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    原位雜交實驗

    原位雜交實驗
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    原位雜交(in situ hybridization, ISH)是用標記的DNA或RNA為探針,根據堿基互補配對原則,在原位檢測組織細胞內特定核酸序列的方法。根據探針的標記物是否直接被檢測,原位雜交可分為直接法和間接法。直接法主要用放射性同位素、熒光及某些酶標記的探針與靶核酸進行雜交,通過放射自顯影、熒光顯微鏡術或成色酶促反應直接顯示。間接法用半抗原標記探針,通過免疫組織化學法對半抗原定位,間接顯示探針與靶核酸形成的雜交體。非放射性標記的原位雜交具有安全、經濟、靈敏度高等優點,因而生物素標記探針digaoxin標記探針迅速發展。
    標記探針迅速發展。
    1、原位雜交(digaoxin)實驗流程

    1. 蛋白酶K處理

    2. 預雜交

    3. 探針變性

    4. 雜交

    5. 洗滌

    6. 消化殘余的RNA

    7. 封閉液封閉30min。

    8. 抗體孵育1~2h。

    9. 洗滌

    10. 顯色BCIP/NBT顯色液加至標本上避光顯色20min。若無背景出現可繼續顯色過夜。

    11. 核固紅復染,充分自來水沖洗。

    12. 梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片,光鏡觀察拍照。


     
    2、熒光原位雜交實驗流程(FISH)
    1、脫蠟
    2、蛋白酶處理
    3、變性
    4、雜交
    5、雜交后水洗
    6、檢測
    7、擴增
    8、DAPI封片,熒光顯微鏡拍照。


       



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