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    單細胞實時定量PCR技術服務

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    單細胞實時定量PCR技服務
        單細胞qRT-PCR是在單細胞水平上對基因的表達進行實時定量分析的技術。常規的qRT-PCR所得結果是數以百萬計的細胞的平均水平,只能說明基因在一個細胞群中大致的表達情況。由于細胞的異質性,相同組織的單個細胞實際上可能彼此不同,并扮演不同的角色。
    單細胞qRT-PCR技術不僅避免了組織水平分析時造成的異質細胞干擾,使得基因表達研究更加精細、準確,而且還能夠檢測導致細胞分型甚至細胞間惟一差別的表達特征,因而獲得了極大關注。
        單細胞qRT-PCR技術為從單核苷酸水平深入研究癌癥發生、發展機制及其診斷、治療提供了新的研究思路并開辟了新的研究方向。近年來,該方法還被廣泛應用于組織器官內細胞基因組的異質性研究、干細胞的異質性研究、以及臨床指導的病理研究等各個方面。
     

    實驗流程:
        由于單個細胞中的mRNA數量很少,大約只有1 pg左右,因而與常規的RT-PCR相比,單細胞RT-PCR在各個環節上都有著顯著差異。常規RT-PCR首先要將組織中的mRNA或總RNA抽提出來之后才能進行后續步驟,單細胞RT-PCR顯然無法進行抽提步驟,因而在獲取單個細胞后,在適當體積的裂解液中將細胞裂解,然后直接以裂解產物為模板進行RT-PCR。由于沒有抽提,裂解產物中含有蛋白質、RNA以及基因組DNA等各種成分,蛋白質因其量極其稀少,可以忽略對單細胞RT-PCR的影響,但裂解產物中的基因組DNA相對于mRNA卻有可能造成極大的干擾。避免這一影響有兩種處理,一是在進行逆轉錄之前先用DNAaseⅠ消化基因組DNA,另一種方法就是在設計PCR引物時盡量使引物結合序列跨越相鄰外顯子的結合處。

    參考文獻:
    Kiyomi T, Tomoharu K, Hideki K(2009)
    Quantitative analysis of gene expression in a single cell by qPCR.Nat Methods. 6(7):503-6.
    Honsa P, et al. (2016) Generation of reactive astrocytes from NG2 cells is regulated by sonic hedgehog. Glia.
    Andrew MD, et al. (2013) Data exploration, quality control and testing in single-cell qPCR-based gene expression experiments. Bioinformatics. 29 (4): 461-467.
    White AK, et al. (2011) High-throughput microfluidic single-cell RT-qPCR.Proc Natl Acad Sci USA.108(34):13999-4004.

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