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  • 膀胱癌中TRMT6 / 61A依賴的堿基甲基化調控基因沉默活性和未折疊蛋白反應

    欄目:最新研究動態 發布時間:2024-03-14
    大多數RNA修飾都集中在信使RNA和轉移RNA上,但缺乏小RNA數據集,此研究結果揭示了通過小RNA的堿基修飾調節基因表達的機制......

           RNA修飾是RNA功能的重要調控元件。然而,大多數RNA修飾的全基因組圖譜都集中在信使RNA和轉移RNA上,但缺乏小RNA的此類數據集。在這里,作者繪制了細胞小RNA空間中的N1 -甲基腺苷(m1 A)。以合成的m1 - A RNA為基準,作者的工作流程確定了含有m1 - A的小RNA的特定組,否則不成比例地代表性不足。特別是,22個核苷酸長的3 ' tRNA片段高度富集于位于種子區的trmt6 / 61a依賴性m1 A。TRMT6/ 61a依賴性m1 - A負性影響trf -3的基因沉默。在TRMT6/61A過表達的膀胱尿路上皮癌中,檢測到tRF上較高的m1 A修飾,與tRF靶組失調相關。最后,TRMT6/61A調節參與未折疊蛋白反應的tRF-3靶點??傊?,作者的研究結果揭示了通過小RNA的堿基修飾調節基因表達的機制。這篇文章于2022年4月發表于《Nature Communication》IF:16.6。
    技術路線


    技術路線圖


    主要研究結果
    1. 小RNA空間中m1A位點的系統制圖
           已知m1A會中斷常規的沃森-克里克A:U堿基配對(圖1a),并在為HTS準備文庫時導致逆轉錄酶(RT)停滯。該特性可用于通過m1A位置的錯配(錯誤結合)來繪制m1A位點。為了系統地繪制小RNA(<50個核苷酸長)中潛在的m1A位點,作者結合了兩種獨立的方法(圖1b): m1A抗體富集,然后進行小RNA測序(m1A- rip -seq)和m1A誘導的錯配測序。為了首先確定用于標準小RNA測序的m1A兼容RT,使用具有單個m1A位點的合成小RNA測試了三種候選RT (protoscriptii -一種常用的M-MuLV RT,tgir -模板切換組II逆轉錄酶和工程HIV RT-1306)。選擇TGIRT和RT-1306進行測試是基于它們之前在測序含有m1a的mRNA和tRNA方面的成功。實驗流程(圖1c,左下)如下:小RNA先與3′端接頭連接,然后與5′端接頭連接,然后引物啟動RT反應生成cDNA,然后用覆蓋兩個接頭序列的引物進行PCR擴增。作者的策略確保只有可讀取的產品將被克隆并用于下游的錯配分析,以進行m1A修改估計。通過在RT步驟之前包括5 '接頭連接,作者消除了由于與PCR擴增的5 '引物缺乏互補性而導致任何RT延遲產物被克隆為截斷產物的可能性。這種方法對于小RNA是首先考慮的,因為它們通常只有幾個堿基不同,特別是對于trf。例如,18-nt tRF-3和22-nt tRF-3已被證明通過不同的機制調節LTR功能。使用這一工作流程,合成m1A位點的錯配指數(由A到T/G/C突變計算)對于TGIRT和RT-1306來說,在不同的m1A化學計量中都顯示出很高的靈敏度和動態范圍(圖1c)。然而,當m1A存在于<=60%的合成短RNA中時,通常用于短RNA測序的逆轉錄酶ProtoScriptII產生的錯配率低于5%(圖1c)。與TGIRT和RT-1306相比,克隆頻率較低,當100%的RNA具有m1A時可以看出(圖1d)。最后,當與m1A抗體富集(m1A- rip)結合使用時,TGIRT和ProtoScriptII都能夠檢測到插入細胞小RNA的合成m1A RNA的富集(圖1e)?;谏鲜龇治?,作者選擇了TGIRT來進一步鑒定內源性m1A小RNA。


    圖1小RNA空間中m1A位點的系統制圖


    2. 特異性tRNA衍生片段高度富集于m1A
           為了鑒定內源性含有m1A的小RNA,將m1A RIP應用于細胞中純化的短RNA。HEK293T細胞中m1A修飾的tRNA通過m1A RIP富集并洗脫成功(圖2a)。對于有一個堿基錯配的tRF reads, m1A RIP的富集更為突出,可能是在m1A修飾的位點(圖2b)。在microRNAs或其他小RNA中,m1A RIP未觀察到這種錯配相關的富集(圖2b)。在m1A RIP后,大多數含有錯配的tRF讀取具有A到C/G/T不匹配(細胞質tRF為90%,線粒體tRF為95%)(圖2b),表明修飾的(容易錯配的)腺苷特異性富集,最有可能是m1A。
           根據起始和結束位置,tRNA片段可以分為三組(圖2c)22,30,34:(1)映射到成熟tRNA的極端3 ' CCA端的tRF-3s,(2)映射到成熟tRNA的極端5 '端的tRF-5s,以及(3)包含前體tRNA的尾鏈序列(通常以poly-U結尾)的tRF-1s。成熟tRNA的3′端trf優先被m1A抗體富集,而5′端trf相對microRNA輕度富集,tRF-1s不富集(圖2d, e)。此外,與18-nt tRF-3a相比,22-nt tRF-3b被m1A抗體特異性富集(圖2f),這表明只有22-nt而不是18-nt tRF-3s含有m1A。值得注意的是,tRF-3b(圖2f)的富集程度與峰值控制的m1A RNA(圖1e)相似。輸入樣品的TGIRT誤摻入特征也得到了m1A在特定trf -3上的位置和化學計量。在所有22 nt的tRF-3b的第四個位置(A4)觀察到最高的錯配率(圖3b, c)。這種高錯配率具有高度特異性:在tRF-3b的其他位置(圖3c)或18 nt的tRF-3a上沒有觀察到。有趣的是,一些microRNA被m1A RIP顯著富集(圖2d),但未能顯示位點特異性錯配模式,因此作者在本報告中沒有將它們報道為真正的含有m1A的小RNA(在Discussion中進一步討論)。這些都表明tRF-3b是含有m1a的小RNA。
           由于確定的大多數m1A位點都處于高化學計量,因此作者跳過了m1A RIP,僅使用TGIRT錯配特征來量化特定位點的m1A,以便進行以下分析。


    圖2特異性tRNA衍生片段高度富集于m1A


    3. 22個核苷酸3 ' tRNA片段上的m1A依賴于TRMT6/61A
           22-nt tRF-3b上的A4位置與成熟tRNA上的A58位置相對應(圖3a)。胞質tRNAs上的m1A58由異源二聚體酶復合物TRMT6/TRMT61A(或酵母中的GCD10/GCD14)催化。為了測試tRF-3b上的m1A是否由TRMT6/61A引入的修飾(可能在親本tRNA上),在TRMT6/61A敲低后評估了錯誤合并特征(圖3b-e)。當TRMT6/61A被敲除(圖3d)時,除了tRNAiMet中的trf -3外,m1a依賴的trf -3錯結合在全球范圍內減少(圖3b, c)。在HeLa和U251細胞中也觀察到siTRMT6/61A或單獨使用siTRMT61A的較低的tRF-3b A4錯摻率(圖3f)。盡管TRMT6/61A敲除后,攜帶ProtoScriptII的tRF-3b的克隆頻率顯著增加,但Northern blots未檢測到tRF-3b和tRNA的穩態水平有任何變化(圖3g)。這證實了攜帶m1a的小RNA在這種常用的ProtoScriptII RT中代表性不足。


    圖3 22個核苷酸3 ' tRNA片段上的m1A依賴于TRMT6/61A


    4. m1A減弱了trf -3的基因沉默
           m1A在tRF-3上特定位置的存在提出了一種有趣的可能性,即它可能調節tRF-3的功能,特別是如果它涉及堿基配對或蛋白質結合。已經在多種生物學途徑中發現了trf -3,特別是依賴于引導小RNA(trf -3)與靶RNA之間堿基配對的基因沉默途徑(圖4a)。這些依賴ago的基因沉默機制可能受到tRF-3s 4位m1A的影響,該位置位于與目標RNAs25,45堿基配對所必需的種子區。
           為了直接測試m1A對tRF-3b基因沉默活性的影響,作者生成了雙熒光素酶報告基因,在Renilla熒光素酶基因的3 ' UTR中有tRF-3靶位,可以歸一化為螢火蟲熒光素酶信號(圖4b)。只有未經a4修飾的tRF-3b觸發了基因沉默,而m1a4修飾的tRF-3b則消除了這種基因沉默(圖4c-f)。對來自不同氨基酸群的四個不同的tRF-3b序列(tRNALeu的tRF-3009b, tRNAAla的tRF-3021b, tRNATyr的tRF-3030b和tRNAGln的tRF-3004b)觀察到這種效應。
           為了確保tRF的抑制不是過度表達的產物,作者還通過LNA(鎖定的核酸)敲低了內源性tRF-3??箃RF-3021特異性地抑制了tRF-3021報告因子的活性(圖4)。同樣,tRF-3009、tRF-3030和tRF-3004報告基因活性被相應的LNAs去抑制(圖4h-j)。
           總的來說,這表明由于種子退火到靶mRNA的問題,m1A減弱了tRF-3b的基因沉默。


    圖4 m1A減弱了trf -3的基因沉默


    5. TRMT6 / 61A依賴性m1A不降低tRF-3b的Argonaute相關性
           由于tRF-3b上的m1A阻止了tRF-3b的沉默(圖4),作者測試了這種修飾是否降低了內源性trf -3與Ago2的關聯。為此,作者創建了一個穩定表達flag - ha標記的Ago2的細胞系(圖5a)。tgrt -seq在前100個與ago2相關的小RNA中鑒定出了trf -3(圖5b)。敲除TRMT6/61A后(圖5c),與m1A修飾相對應的讀段錯配百分比在與ago2相關的片段中(a)減少,但在與ago2相關的片段中(b)相對于輸入片段而言,沒有增加或減少(圖5d)。因此,TRMT6/61A對兩個片段中trf -3上的m1A的調節是相同的。m1A修飾不排除tRF-3b進入與Argonaute的復合物。在敲除TRMT6/61A后,ago2相關部分中有幾種trf -3的少量(1-3倍)增加,但沒有超過FDR <0.05的閾值(圖5e)。相對于輸入部分,Ago相關部分中tRF-3水平沒有任何變化,這表明trmt6 /61依賴的m1A對tRF-3種子區域的修飾不會顯著影響Ago的直接結合。有趣的是,盡管在輸入和Ago結合的部分中,TRMT6/61A調節了總tRF-3b錯配(m1A修飾)的百分比(圖5d)。綜合來看,m1A修飾的tRF-3s不會降低它們的Ago關聯,因此基因沉默的衰減很可能是因為與目標mRNA的堿基配對減少(圖4)。


    圖5 TRMT6 / 61A依賴性m1A不降低tRF-3b的Argonaute相關性


    6. tRF-3b介導的m1a依賴性基因沉默變化
           引導RNA 2-4位的堿基配對對于ago介導的基因沉默至關重要45。tRF-3b上的m1A特異性位于第4位(圖2和圖3)。由于m1A阻斷了典型的A:U堿基配對,作者假設,m1A在tRF-3種子區與靶RNA的堿基配對減弱,解釋了含有m1A的tRF-3中觀察到的基因沉默活性降低(圖4)。為了驗證這一假設,作者首先通過圖6a總結的策略確定了可能受m1A狀態調節的潛在tRF-3靶RNA。作者確定了頂部ago2相關的tRF-3b中的哪些種子(圖6b)也是TRMT6/61A敲除后m1A修飾減少最多的種子,以確定最有可能遭受生物學上顯著的靶標預測干擾的種子(圖6c)。作者根據3 ' UTR中的互補性預測這些種子的靶標。RNA-seq顯示,當TRMT6/61A被敲除,tRF-3b在第4位被m1A低修飾時,這些種子的靶標比非靶標明顯受到抑制(圖6d)。
           預測具有8-mer和7-mer匹配的靶標比種子中與6-mer匹配的靶標受到更顯著的抑制(圖6d, e)。在siTRMT6/61A之后,分別通過qPCR驗證了最顯著抑制的8/7-mer tRF-3靶標(TIMP3, CREB3L2, MBTPS1, CDK19, HIPK2, HERPUD1, RMND5A, ELMOD2和HLTF)的抑制(圖6f)。
           為了證實這種基因抑制是由靶向3 ' UTR的tRF-3介導的,作者將具有單個進化保守的tRF-3靶向8-mer位點的內源性MBTPS1 3 ' UTR序列克隆到雙熒光素酶報告基因中。MBTPS1 3 ' UTR報告基因確實被siTRMT6/61A抑制(圖6g)。另一個8-mer靶基因CREB3L2也得到了類似的結果(圖6g)。這兩個8-mer位點均由種子序列“TCAAATCT”預測,由tRNAGln中的tRF-3b代表(圖6b)。與預測一致,通過從tRNAGln中過表達未經修飾的tRF-3004b可以模擬sitrmt依賴性抑制,而TRMT6/61A的表達不會減少(圖6h),而m1a修飾的tRF-3004b對3 ' UTR報告基因的抑制能力明顯較弱(圖6i)。綜上所述,tRF-3可以通過種子與目標3 ' UTRs配對來調節基因的全局表達,而這一過程受到tRF-3種子區m1A修飾的干擾。


    圖6 tRF-3b介導的m1a依賴性基因沉默變化


    7. 膀胱癌中trf - 3m1a水平及tRF-3靶點的改變
           據報道,一些tRNA修飾酶,包括TRMT6/61A,在幾種癌癥類型中顯著上調47。TRMT6上調在膀胱尿路上皮癌(BLCA)中是顯著的(圖7a)。最重要的是,通過western blotting檢測到腫瘤樣品中TRMT6和TRMT61A蛋白水平的顯著上調(圖7b, c)。
           TRMT6表達水平與tRF-3b整體m1A錯配水平呈正相關,并且在BLCA腫瘤樣本中m1A錯配顯著增加,這與TRMT6/ 61a較高的表達水平一致(圖7d, e)。與較高水平的干擾m1A修飾相一致,在作者的實驗數據中,與正常相比,通過種子-mer匹配預測的tRF-3b靶RNA在BLCA腫瘤樣本中比非靶點上調(圖7f)。組合種子和補充圖7e:單個種子)。此外,在TCGA BLCA數據中,TRMT6水平高的腫瘤誘導了tRF-3b靶點(圖7g)。有趣的是,在被siTRMT6/61A抑制的9個trmt3靶點中,有8個(圖6e)在TCGA膀胱患者樣本中與TRMT6的表達呈顯著正相關(圖7h)。綜上所述,這些結果表明TRMT6/61A調節腫瘤中tRF-3上的m1A水平,并且BLCA中TRMT6/61A的升高與腫瘤中tRF-3靶點的預期誘導有關。


    圖7膀胱癌中trf - 3m1a水平及tRF-3靶點的改變


    8. TRMT6/61A修飾tRF-3b對于維持未折疊蛋白的反應至關重要
           為了探索m1a依賴性tRF-3靶點的潛在生物學功能,作者通過RNA-seq數據的基因集富集分析,重點研究了siTRMT6/61A顯著下調和高trmt6腫瘤樣本中顯著上調的生物學途徑。針對1532個Reactome通路的富集分析在細胞系和患者數據中發現了7個重疊通路。其中一種途徑是未折疊蛋白反應或UPR(圖8a, b)。
           m1a依賴的tRF-3靶點,特別是MBTPS1(也稱為1位點蛋白酶或S1P)和CREB3L2,先前與UPR和蛋白質分泌有關48,49,這表明TRMT6/61A可能通過去抑制這些tRF-3靶點來幫助維持生長細胞中的UPR。MBTPS1 (S1P)因其切割和激活高爾基體上不同蛋白質底物的作用而聞名,包括轉錄因子ATF6和creb3l250,51,52。為了直接測試TRMT6/61A是否在內質網應激下調節UPR,作者使用了一個由最小啟動子驅動的熒光素酶報告子,該啟動子帶有內質網應激反應元件2 (ERSE2),可被ATF6轉錄因子53激活。報告顯示,正如預期的那樣,熒光素酶活性增加依賴于內質網反應元件和內質網應激(tunicamycin, Tm)。在HEK293T和T24膀胱癌細胞系中,TRMT6/61A敲低可顯著抑制UPR誘導的應激反應(圖8c)。轉染未修飾的tRF-3004b,而不轉染m1A修飾的tRF-3004b,相對于NT1和NT2非靶向RNA,可以降低UPR報告基因的活性(圖8d),這表明tRF-3b上的m1A狀態可以直接調節未折疊蛋白的反應。為了確保內源性tRF-3004b抑制參與UPR的靶基因,作者通過LNA敲低了內源性tRF-3004b,這在ER應激后顯著增加了靶細胞基因CREB3L2、HERPUD1、MBTPS1和HLTF的水平(圖8e、f)??傊?,這表明trmt6 / 61a介導的trf -3上的m1A修飾對維持UPR穩態很重要。


    圖8 TRMT6/61A修飾tRF-3b對于維持未折疊蛋白的反應至關重要


    結論
           最后,快速增殖的癌細胞通過激活促存活UPR來維持蛋白穩態以減輕內質網應激。因此,UPR與癌癥特征的許多方面密切相關,并已成為有希望的治療靶點。先前已經注意到,在包括膀胱癌在內的幾種癌癥類型中,uprr相關基因在全球范圍內上調68。在這里,作者發現TRMT6/61A最可能通過修飾tRF-3來促進UPR,并去抑制tRF-3在UPR通路的ATF6分支中的靶點MBTPS1和CREB3L2。有趣的是,MBTPS1和CREB3L2可以被tRNAGln中的tRF-3004b靶向,tRNAGln是一種被發現在酵母中調節UPR的tRNA 69。當然,作者不排除TRMT6/61A通過修飾tRNA和mRNA對UPR產生額外影響的可能性。作者如何利用本文描述的機制使腫瘤細胞對促凋亡UPR敏感將是未來另一個有趣的研究課題。

    實驗方法
    細胞培養,RNA凈化,合成m1A RNA寡核苷酸,RIP免疫沉淀反應,小RNA-seq文庫制備,小RNA-seq圖譜和錯配分析,敲低TRMT6/61 A,Northern blot,雙熒光素酶報告試驗,鎖定核酸(LNA)敲除內源性tRF,RT-qPCR,RNA-seq文庫的制備和分析,蛋白提取和Western Blot,未折疊蛋白反應報告試驗。
    參考文獻:
    Su Z, Monshaugen I, Wilson B, Wang F, Klungland A, Ougland R, Dutta A. TRMT6/61A-dependent base methylation of tRNA-derived fragments regulates gene-silencing activity and the unfolded protein response in bladder cancer. Nat Commun. 2022 Apr 20;13(1):2165. doi: 10.1038/s41467-022-29790-8. PMID: 35444240; PMCID: PMC9021294.


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