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  • 自噬基因ATG16L1的腫瘤內在表達抑制了結直腸癌的抗腫瘤免疫

    欄目:最新研究動態 發布時間:2024-03-13
    最近使用腫瘤細胞系模型的研究表明,核心自噬通路的成員是免疫抑制的腫瘤內源性或外源性決定因素,但它們的轉化相關性仍不清楚......



           近年來,免疫檢查點抑制劑(ICI)如抗PD-1、PD-L1和CTLA-4的單克隆抗體已被證明在許多癌癥類型中具有臨床療效。然而迄今為止,只有一小部分結直腸癌(CRC)患者對ICI有應答。因此,揭示MSS-CRC中ICI耐藥的決定因素對于通過新型治療組合解鎖抗腫瘤免疫至關重要。炎癥性腸病的全基因組關聯研究揭示了與腸道炎癥增加相關的關鍵通路。其中,調節caspase介導的降解的核心自噬基因ATG16L1的一個錯義變異體被確定為克羅恩病的高度顯著風險等位基因,以及CRC14和胃癌的推測預后因素。ATG16L1是自噬分解代謝過程所需的e3連接酶樣自噬體延伸復合體的關鍵成分。自噬在腸上皮細胞適應性中發揮重要作用。此外,自噬通過多種機制調節固有和適應性免疫,包括抗原呈遞、效應T細胞功能和調節程序性細胞死亡。最近使用腫瘤細胞系模型的研究表明,核心自噬通路的成員是免疫抑制的腫瘤內源性或外源性決定因素,但它們的轉化相關性仍不清楚。該研究發表在《Nature Communications》,IF:16.6。
    技術路線


    主要研究結果
    1. ATG16L1表達升高預測攜帶致癌性KRAS突變的CRC患者免疫治療反應差
           為了評估ATG16L1表達是否與非MSI CRC對ICI的應答相關,研究者評估了IMblaze370的腫瘤基因表達數據。研究者比較了抗PD-L1單藥治療與抗PD-L1與MAP激酶通路抑制劑考比替尼聯合治療。瑞戈非尼單藥治療被用作標準治療對照組。
           對非高MSI腫瘤中的ATG16L1轉錄水平所做的分析表明,在KRAS突變型腫瘤中,在阿替利珠單抗和阿替利珠單抗+考比替尼聯合治療組中,ATG16L1表達水平升高均與較差的總生存期相關,但在KRAS野生型腫瘤中未見相關(圖1a)。相反,在瑞戈非尼組中,ATG16L1轉錄水平與有差異的結局無關(圖1a)。ATG16L1表達與腫瘤上皮標簽呈正相關,與免疫和間質標簽呈負相關,提示ATG16L1表達的主要來源是腫瘤細胞(圖1b)。IMblaze370腫瘤樣本的組織病理學評估顯示,ATG16L1蛋白水平主要在腫瘤上皮內升高,少量位于腫瘤間質(圖1c)。人CRC腫瘤的單細胞基因表達分析證實,與CRC腫瘤微環境的其他細胞區室相比,腫瘤上皮中的ATG16L1轉錄水平升高(圖1d,e)。
           接下來,研究者研究了KRAS狀態是否與ATG16L1低表達和高表達腫瘤的轉錄譜差異相關。使用CIBERSORT40進行的免疫細胞去卷積分析顯示,ATG16L1低表達的腫瘤顯示了KRAS突變環境中T細胞和NK細胞浸潤增加的明顯更強證據(圖1f)。因此,在KRAS突變患者中,接受免疫治療的ATG16L1低表達患者的生存改善與T細胞和NK細胞浸潤增加相關。綜上,在非MSI CRC中,ATG16L1低水平腫瘤患者可能會產生更炎癥的微環境,從而在阿替利珠單抗檢查點抑制時促進產生高效的抗腫瘤免疫應答。


    圖1 在攜帶致癌性KRAS突變的非高微衛星不穩定型結直腸癌患者中,ATG16L1表達升高與免疫治療的不良結局相關


    2. 腫瘤內源性ATG16L1促進體內細胞免疫抵抗
           在晚期CRC中,ATG16L1表達水平升高與不良結局相關,這一觀察結果促使研究者從功能上評估了其在CRC進展中的作用。首先,通過對小鼠結腸類器官進行CRISPR-Cas9編輯,研究者開發了攜帶在MSS-CRC中觀察到的關鍵驅動突變的腫瘤模型。研究者依次引入了腫瘤抑制因子Apc、Trp53、Smad4的功能缺失和Kras的致癌功能獲得,以生成轉化的CRC類器官(AKPS,圖2a)。ATG16L1通過脂化LC3/ATG8家族的泛素樣蛋白16來驅動自噬體延伸。在ATG16L1敲除的CRC類器官克隆中,研究者證實了脂質化LC3b的完全缺失(圖2b)。一類稱為sequestosome樣受體(SLRs)的蛋白質的累積是自噬流缺陷和ATG16L1缺失的標志。與lc3-ⅱ缺失一致,與對照(WT)CRC類器官相比,ATG16L1敲除(KO)中SLRs SQSTM1/p62和CALCOCO1水平升高(圖2b)。
           結直腸癌轉移主要發生在肝和肺。研究者分別使用改良的水動力尾靜脈注射方案和傳統的靜脈尾靜脈注射將CRC類器官直接輸送到肝臟和肺。將CRC類器官原位注射到結腸上皮中用于在原發疾病龕中建立腫瘤。通過生物發光(BLI)成像觀察穩定表達的熒光素酶報告基因在肝和肺模型中的腫瘤生長情況。在完全免疫正常的宿主中,ATG16L1缺失顯著降低了肝臟腫瘤負荷(圖2c,d,i)。接種后6周,給予WT CRC類器官的小鼠的肝臟顯示出廣泛的疾病負擔,而給予ATG16L1 KO CRC類器官的少數小鼠僅出現偶爾的腫瘤灶(圖2i)??傊?,研究者的數據表明ATG16L1促進免疫正常小鼠的CRC生長,而不依賴于組織生態位。由于IMblaze370研究了轉移后CRC的患者結局,因此研究者的后續實驗側重于CRC類器官的肝臟定植。
           ATG16L1缺失不影響體外AKPS類器官的基礎生長,這提示腫瘤內在的ATG16L1缺失可能引發體內控制疾病的腫瘤外源性機制。研究者將WT和ATG16L1 KO CRC類器官植入免疫受損宿主的肝臟(圖2e-h)。NOD/SCID-gamma IL2Rgnull(NSG)小鼠是研究人類腫瘤細胞在體內生長的常用小鼠。與細胞免疫在控制腫瘤生長中的作用一致,野生型CRC類器官在NSG宿主中比免疫正常的BL6小鼠生長更快。值得注意的是,ATG16L1 KO CRC類器官在NSG宿主中快速生長(圖2e,h),并且在免疫正常的對照BL6宿主中達到與WT CRC類器官相同的程度(圖2d)。雖然ATG16L1 KO組的腫瘤負荷與WT組相比仍然顯著降低,但給予ATG16L1 KO CRC類器官的所有NSG小鼠均表現出較大的腫瘤結節(圖2j)。
           為了進一步完善這些觀察結果,研究者分別去除宿主細胞毒性T淋巴細胞或自然殺傷(NK)細胞,然后植入CRC類器官。有趣的是,耗竭NK細胞顯著恢復了ATG16L1 KO CRC類器官的生長,而耗竭CD8+T細胞無顯著影響(圖2f,h)。因此,NK細胞似乎是清除ATG16L1缺陷的MSS-CRC的關鍵因素。
           接下來,研究者使用Ifng KO小鼠研究IFNγ是否參與腫瘤控制,IFNγ是驅動細胞毒性T細胞和NK細胞效應功能的關鍵細胞因子。與野生型對照宿主相比(圖2d),如BLI定量所示,宿主IFNγ缺失顯著增加了ATG16L1 KO CRC類器官的肝臟定植(圖2g,h),提示宿主IFNγ在體內抑制ATG16L1缺陷型CRC類器官的生長??傮w而言,研究者觀察到ATG16L1缺陷的CRC類器官在免疫受損宿主的肝臟中生長改善(圖2h)。研究者的結果表明,不依賴于組織生態位,腫瘤固有的ATG16L1極大地限制了CRC的免疫介導控制。而當腫瘤在免疫缺陷宿主中生長時,其影響相對較小。


    圖2 ATG16L1通過促進細胞免疫抵抗來驅動肝內CRC生長


    3. ATG16L1的缺失改變了CRC類器官的組成和表型
           為了更好地理解ATG16L1如何影響腫瘤及其微環境中細胞的表型編程,研究者對植入NSG小鼠肝臟中的腫瘤進行了轉錄組學分析,因為ATG16L1 KO CRC類器官的最佳生長需要免疫缺陷宿主。收集腫瘤并將活細胞分選為CRC類器官和白細胞組分。通過單細胞RNA測序分析每組的分選部分。對類器官細胞和免疫細胞的數據分別進行預處理和標準化。將類器官細胞和免疫細胞池分別過濾,僅保留上皮細胞和髓樣細胞。
           研究者首先聚焦于腫瘤固有狀態,其中無監督圖聚類揭示了上皮CRC細胞的8個簇:增殖(Prolif.),分泌/感覺(SS),成熟腸細胞(ME),神經內分泌(NE),腸祖細胞,干擾素反應(IFN),StemHI和Goblet/Paneth(GP)細胞簇(圖3a,b)。
           細胞類型比例的比較表明,ATG16L1缺失顯著改變了體內CRC類器官細胞的組成(圖3c-e)。在ATG16L1 KO組中,IFN反應性CRC細胞的比例顯著增加,指向依賴自噬的腫瘤固有免疫抑制過程(圖3e)。ATG16L1 KO組的NE和SS反應簇也呈比例增加(圖3e)。相比之下,在ATG16L1 KO組中,GP細胞的比例顯著降低,突顯了ATG16L1在維持杯狀細胞和潘氏細胞身份方面的重要作用(圖3e)。最后,ATG16L1缺失導致StemHI和增殖細胞簇成比例減少(圖3e)。
           ATG16L1缺失也改變了每個簇內CRC類器官細胞的轉錄狀態?;蚣患治鲲@示,除了顯著增加的IFN反應簇外,在ATG16L1 KO組中,StemHI和GP細胞簇也表現出更高水平的IFN反應基因,這與炎癥性腫瘤微環境的產生、腫瘤對IFN的內在敏感性增加或兩者的某種組合一致(圖3f)。此外,在ATG16L1缺失后,除IFN應答簇外,所有簇均顯示上皮-間充質轉化(EMT)相關基因水平升高(圖3f)??紤]到與EMT樣特征密切相關的NE簇的比例增加,這一結果凸顯了EMT是ATG16L1 KO條件中最顯著的變化之一。以上結果表明,即使在免疫功能低下的NSG宿主中,TME也可能通過增強IFN反應對ATG16L1缺陷腫瘤施加選擇性壓力。
           研究者接下來的問題是,在體內植入的ATG16L1缺陷腫瘤中觀察到的轉錄變化中,哪些是真正的腫瘤固有的。為了嚴格關注ATG16L1的腫瘤內在效應,研究者對體外培養的WT和ATG16L1 KO CRC類器官進行了批量RNA-seq分析。對單細胞來源的細胞簇的前100個標記物進行GSEA分析,發現ATG16L1缺失導致Prolif的表達顯著降低。和GP簇標志物,以及SS簇標志物表達增加(圖3g,h),表明這些是腫瘤細胞中ATG16L1缺失導致的直接變化。相比之下,其他簇的變化顯然是由TME介導的(圖3e-g)??傊?,這些數據提示,ATG16L1缺失導致CRC類器官中的杯狀細胞、帕內特細胞、干細胞和增殖池減少,可能抑制腫瘤生長。同時,增強的IFN反應性可能增加抗腫瘤免疫壓力。


    圖3 ATG16L1的腫瘤內在缺失改變了肝臟中CRC細胞的表型和組成


    4. 結直腸癌類器官中ATG16L1的缺失重塑了腫瘤髓系隔室
           接下來,研究者探討了腫瘤內在ATG16L1缺失如何影響造血腫瘤微環境。由于ATG16L1 KO CRC類器官在免疫正常的BL6宿主中未形成腫瘤,因此研究者的分析僅限于NSG宿主中生長的腫瘤的髓系室。在本研究中,研究者對NSG小鼠肝臟內種植的WT和ATG16L1 KO腫瘤分選的髓系細胞進行了scRNA-seq分析,這些髓系細胞分為10個簇(圖4a,b)。巨噬細胞亞群包括TREM2+、VSIG4+、MARCO+和ifn反應性巨噬細胞/單核細胞的混合簇。樹突狀細胞聚集成cDC1、cDC2、CCR7+DC和漿細胞樣DC。另外兩種不同的細胞群是單核細胞和中性粒細胞。在CRC類器官中ATG16L1的缺失導致了髓系室的實質性重塑。ATG16L1 KO組單核細胞以及TREM2+和VSIG4+巨噬細胞亞群顯著減少(圖4c-e)。ATG16L1缺失后,中性粒細胞募集增強,這與即使在NSG宿主中炎癥活動增加一致(圖4e)。正如無偏倚GSEA分析中IFN反應特征的增加所表明的那樣,大多數巨噬細胞和DC亞群顯示了復極化進入炎癥狀態的證據(圖4f)。IFN反應的混合巨噬細胞/單核細胞簇的百分比顯著增加(圖4e),并且在ATG16L1 KO條件下表現出更強的IFN反應(圖4f)。這些結果表明,腫瘤固有的ATG16L1缺失不僅重編程CRC細胞,而且導致髓系室向抗腫瘤狀態的促炎重塑。


    圖4 腫瘤內ATG16L1缺失可重編程腫瘤微環境中的髓系細胞組成和表型


    5. ATG16L1保護CRC類器官免受TNF+ifnγ介導的程序性細胞死亡
           細胞毒性淋巴細胞和IFNγ對ATG16L1 KO腫瘤的清除增加,以及NSG小鼠中ifn應答基因標簽的持續增強,促使研究者直接確定腫瘤內源性ATG16L1在調節IFNγ信號傳導中的作用。首先,在體外IFNγ刺激下對野生型和ATG16L1 KO型結直腸癌類器官進行基因表達譜分析。在IFNγ處理的CRC類器官中,ATG16L1的缺失顯著增強了IFN通路基因的表達(圖5a,b)。之前的研究表明,在高度轉化的細胞系或原代腸上皮細胞中,自噬抑制使其對TNF或IFNγ誘導的細胞毒性敏感,與之相反,IFNγ或TNF單獨在體外無法誘導CRC類器官死亡(圖5c,d)。然而,TNF和IFNγ聯合使用可誘導CRC類器官死亡。重要的是,ATG16L1的缺失顯著加速了TNF和IFNγ共同處理誘導的細胞死亡(圖5c,d)。
           接下來,研究者研究了參與細胞因子介導的細胞死亡的信號通路。有趣的是,重要的程序性壞死介質RIPK3和混合譜系激酶結構域樣蛋白僅在ATG16L1 KO類器官中被磷酸化(圖5e)。在ATG16L1 KO CRC類器官中,Ripk3缺失部分挽救了TNF+ifnγ誘導的死亡,在ATG16L1和Ripk3雙重缺失的細胞中添加z-VAD可完全阻斷細胞死亡(圖5f)。抑制ATG16L1 KO類器官中的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶可進一步加速細胞死亡,這可能是通過RIPK3介導的程序性壞死實現的,這與半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶在程序性壞死中的調節作用一致??傊?,這些結果表明ATG16L1的缺失使CRC類器官對TNF+ifnγ誘導的程序性壞死和凋亡敏感。


    圖5 ATG16L1缺失使CRC類器官對TNF+ifnγ誘導的細胞死亡敏感


    結論
           該研究表明,CRC中ATG16L1的高表達預示著較差的免疫治療應答,這在機制上可以通過ATG16L1介導的IFN信號傳導抑制和隨后的細胞免疫抑制來解釋。這為在晚期MSS-CRC中通過抑制自噬來克服免疫療法耐藥提供了治療理論依據,而MSS-CRC是一種可選擇的治療方案有限、臨床結局不佳且未滿足的需求高的疾病。

    實驗方法
    生物發光成像,蛋白質印跡,流式細胞術,細胞死亡測定,免疫組織化學染色,全外顯子組測序,TCGA分析,生存分析,單細胞RNA測序
    參考文獻
    Taraborrelli L, ?enbabao?lu Y, Wang L, Lim J, Blake K, Kljavin N, et al. Tumor-intrinsic expression of the autophagy gene Atg16l1 suppresses anti-tumor immunity in colorectal cancer. Nat Commun. 2023 Sep 23;14(1):5945. doi: 10.1038/s41467-023-41618-7.


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