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  • 中和IL-8可以增強膠質瘤ICB療效

    欄目:最新研究動態 發布時間:2024-02-29
    盡管免疫檢查點阻斷(ICB)療法在治療多種腫瘤方面取得了顯著的成功,但ICB療法治療惡性膠質瘤的臨床益處仍然有限......

           

           惡性神經膠質瘤預后很差,由于標準治療的選擇有限,仍然具有挑戰性。盡管免疫檢查點阻斷(ICB)療法在治療多種腫瘤方面取得了顯著的成功,但ICB療法治療惡性膠質瘤的臨床益處仍然有限。因此探究聯合靶點是十分必要的,該文于2023年4月發表在《Cancer Cell》,IF=50.3。

    技術路線


    主要研究結果
    1、膠質瘤患者腫瘤浸潤T細胞的解剖分析
           作者測量了腫瘤中的T細胞駐留模式和轉錄組,膠質瘤組織和外周血樣本上的表面標記和轉錄組,樣本包括51名低級別膠質瘤(LGG)患者和101名高級別膠質瘤(HGG)患者(圖1A)。作者首先用H&E和免疫組織化學(IHC)對71例膠質瘤患者的腫瘤組織進行染色,包括HGG和LGG。值得注意的是,大多數T細胞位于微血管區的血管周圍 (圖1B),解剖轉錄圖譜數據證實了這一點(圖1C)。為了弄清是哪種趨化因子受體引導T細胞浸潤到膠質瘤中,作者利用CyTOF檢測了14名新診斷患者的外周血單個核細胞(PBMCs)和膠質瘤組織樣本,其中包括5對PBMCs和組織樣本。作者的研究結果顯示,在所檢測的趨化因子受體中,包括CCR4、CCR5、CCR6、CXCR3和CX3CR1,與外周血相比,只有CCR5和CXCR3在腫瘤CD4+和CD8+ T細胞上的表達均顯著升高(圖1D),這表明需要CCR5和CXCR3來引導T細胞向膠質瘤遷移。


    圖1. 膠質瘤中T細胞的景觀定位和解剖分析


    2、膠質瘤中T細胞單細胞測序
           為了全面剖析腫瘤微環境(TME)中T細胞的異質性,作者從5個新分離的腫瘤和配對的PBMC中分離T細胞,并通過scRNA-seq和單細胞T細胞受體(TCR)測序(scTCR-seq)對它們進行了分析。經過嚴格的質量控制篩選,作者總共獲得了116,205個T細胞(65,990個來自PBMC, 50,215個來自腫瘤)。TCR全庫測序鑒定出67,665個具有配對a鏈和b鏈的T細胞。利用免疫表位數據庫和分析資源(IEDB)工具排除非腫瘤特異性TCR后,剩余的潛在腫瘤反應性TCR克隆型定義為至少兩個T細胞共享的配對a鏈和b鏈。根據先前的報道,T細胞簇根據其居住地、TCR克隆性和特征基因進行分類。在腫瘤和PBMC樣本中共鑒定出18個T細胞簇,包括7個CD4+ T細胞簇,10個CD8+ T細胞簇和1個gd T細胞簇,每個T細胞簇都具有獨特的特征基因(圖2A)。具體而言,CD4+ T細胞區室多樣化,有7個簇。幼稚亞群(C1_CD4_Naive)在血液中占主導地位(圖2B)。中樞記憶亞群(C2_CD4_Tcm)在血液中普遍存在,其特征是IL7R、TCF7、SELL和MYC基因的高表達(圖2B)??寺U增的細胞毒性亞群(C6_CD4_Cyto)細胞高度表達細胞毒性相關基因NKG7、GZMA和GZMK(圖2B-2D)。一個功能失調的亞群(C7_CD4_Dysfun)也被克隆擴增,并以編碼抑制CTLA-4的基因高表達和最低水平的細胞毒性相關基因為標志(圖2C, 2D)。值得注意的是,一個產生IL-8的亞群(C8_CD4_IL8)只在腫瘤中富集,并以IL8、NINJ1、HLA-DRA和HAVCR2高表達為特征(圖2B)。另一個非克隆擴增的T細胞亞群(C9_CD4_Tn-like)高度表達幼稚標記基因和SOCS3(圖2B),因此代表了先前報道的幼稚樣T細胞亞群表達調節性T細胞亞群(C12_Treg)的foxp3被克隆擴增,表明TCR依賴性激活或分化(圖2C、2D)。同樣,轉錄特征和TCR克隆擴增的組合分析顯示CD8+ T細胞有10個主要集群(圖2A),高度克隆擴增的T細胞(TCR克隆大小大于10,TCS > 10)主要位于TME(圖2B-2D)。預衰竭CD8+ T細胞(C3_CD8_Pre-Ex, TCS > 10, 37.8%)表達效應基因NKG7、GZMA、GZMH和GZMK以及表面標記基因LAG3、KLRB1、TIGIT和PDCD1,與之前的鑒定一致,優先位于腫瘤部位(圖2B)。值得注意的是,效應/記憶CD8+ T細胞在pbmc中優先富集(圖2B)。其余4個非克隆或低克隆擴增的CD8+ T細胞簇包括幼稚T細胞簇(C14_CD8_Naive)、中樞記憶亞群(C16_CD8_Tcm)、產生IL-8亞群(C18_CD8_ IL-8)和MGP基因標記的未知簇(C10_ CD8_MGP)。為了探索這6個高度克隆擴增的CD8+ T細胞簇的發育狀態和個體發生關系,作者進行了時間軌跡分析和TCR克隆型評估。作者發現,在CD8+ T細胞總數的背景下,這六種不同的集群形成了發育順序,效應/記憶CD8+ T集群停留在假時間的早期,其次是效應、預衰竭、應激、增殖和衰竭集群(圖2E)?;赥CR克隆型共享度的克隆分析也獨立驗證了這種發育轉變。引人注目的是,三種最常見的腫瘤富集CD8+ T細胞亞群,預衰竭,衰竭和效應亞群,構成了大多數克隆T細胞,并且廣泛地共享它們的克隆(圖2C),表明它們可能是殺死膠質瘤腫瘤細胞的主要局部參與者,并且仍然是膠質瘤的主要免疫治療靶點。為了進一步驗證作者關于趨化因子受體CCR5和CXCR3選擇性標記膠質瘤浸潤T細胞的觀察結果(圖1D),總的來說,作者的發現強調趨化因子受體CXCR3和CCR5是T細胞遷移到膠質瘤并執行腫瘤殺傷功能所必需的。


    圖2. T細胞的單細胞聚集


    3、一種獨特的產生IL-8的CD4+ T細胞群存在于膠質瘤TME中,預示著不良的臨床結果
           作者上面的T細胞圖譜已經鑒定出一種獨特的CD4+ T亞型,它被標記為選擇性表達IL- 8,并且只在腫瘤中富集(圖3A)。進一步關注CD4+ T細胞區室的轉錄組評估顯示,表達IL-8的CD4+ T細胞表現出先天樣特征,大量表達經典巨噬細胞相關效應基因,如IL8、IL1B、CCL3 (MIP-1a)、CCL4 (MIP-1b)和骨髓表面標記基因NINJ1和CX3CR1(圖3B)。然后,作者通過免疫組化、免疫熒光(IF)染色和流式細胞術評估了IL-8、CX3CR1和NINJ1蛋白的表達,發現IL-8蛋白在膠質瘤微血管區周圍的一部分CD4+ T細胞中高表達,與一般T細胞分布模式一致,這些產生IL-8的CD4+ T細胞也高水平表達CXCR3和NINJ1(圖3C)。此外,作者對來自健康供體和膠質瘤患者的75個血液和73個膠質瘤樣本的T細胞進行了流式細胞術分析,觀察到IL-8在腫瘤樣本中活化的CXCR5+ CD4+ T細胞中選擇性表達(圖3D)。盡管如此,血液中表達IL-8的T細胞優先局限于CXCR5 CD4+ T細胞群(圖3D),表明失活或初始CD4+ T細胞。接下來,作者研究了產生IL-8的T細胞簇的免疫特性與臨床結果的相關性。首先,作者描述了關鍵的特征基因表達水平,并將其指定為特征分數。在兩種GBM中,產生IL-8的CD4+ T細胞的特征評分越高,總生存率越差(風險比[HR][95%可信區間(CI)] = 4.09 [2.68, 6.25];p < 0.0001)和LGG患者(HR [95% CI] = 2.98 [2.02, 4.39];p < 0.0001)(圖3E)。IL-8在膠質瘤中的表達與其受體CXCR1和CXCR2均呈正相關,可獨立預測膠質瘤患者預后不良(圖3F)??偟膩碚f,作者的研究證明了一種獨特的產生IL-8的CD4+ T細胞群,這與膠質瘤患者的低生存率有關。


    圖3. 產生IL -8的CD4+ T細胞亞群預示著不良的臨床預后


    4、由腫瘤分泌刺激分化的產生IL-8的T細胞表現出先天樣的特征,具有促進腫瘤生長和骨髓白細胞募集的能力
           膠質瘤浸潤T細胞的偽時間軌跡分析顯示,IL-8的表達僅限于終末分化和非克隆CD4+ T細胞(圖2E),這與IL-8在幼稚CD4+ T細胞(尤其是兒童或臍帶血)中的自發表達形成對比。作者假設膠質瘤中產生IL-8的T細胞被腫瘤因子極化,并且獨立于TCR信號傳導。為了驗證這一假設,作者從健康供體中分離出人類原始CD4+ T細胞,并用膠質瘤培養上清液刺激它們。IL-8在T細胞中的表達以時間和劑量依賴的方式升高至 55%(圖4A)?;诖罅縍NA測序數據的分層聚類分析顯示,體外分化的產生IL-8的T細胞具有與體內CD4_IL8集群相似的基因表達模式(圖4B)。具體來說,2064個基因的表達(增加1487個;down, 577)在體外極化產生IL-8的T細胞和C8_CD4_IL8簇中都發生了相同的變化(圖4B)。通過基因集富集分析(GSEA)和創新途徑分析(IPA)進一步評估超過2倍改變的基因,發現產生IL-8的T細胞上調巨噬相關基因,包括IL-8、IL-1B、IL-6、CCL2、CCL3、CCL4、CCL20、CHI3L1、CX3CR1等,具有類似于膠質瘤相關骨髓細胞的先天分子特征(圖4C和4D),可能在功能上與血管生成、單核細胞/中性粒細胞趨化性、和氧化還原。這些結果共同強調了先天樣IL-8+ CD4+ T細胞作為一種獨特的CD4+ T效應譜系。接下來,作者試圖確定產生IL-8的CD4+ T細胞在膠質瘤中的功能。作者分別以1:1的比例將U373細胞接種到免疫缺陷小鼠的中樞神經系統中,或與幼稚和體外生成的產生IL-8的CD4+ T細胞一起接種。接受IL-8+ CD4+ T細胞的小鼠與初代T細胞小鼠和對照組相比,腫瘤生長明顯(圖4E)。腫瘤浸潤免疫細胞的離體分析顯示,與其他兩組相比,IL-8+ CD4+ T接受組CD45+ CD11b+ Gr1+髓樣細胞顯著增加,供體IL-8+ CD4+ T細胞組成性高表達IL-8(圖4F和4G)。為了進一步驗證產生IL-8的T細胞功能,作者采用另一種膠質瘤異種移植小鼠模型,將20,000個GBM5細胞(作者最近研究中描述的一種原發性膠質母細胞瘤細胞系)接種到免疫功能低下的小鼠腦內(圖4H)。如圖4I所示,供體產生IL-8的T細胞與原位骨髓細胞緊密結合,與對照組相比吸引了更多的骨髓細胞。這些結果共同強調了IL-8+ CD4+ T細胞在腫瘤中的促腫瘤功能、對髓系白細胞的趨化性和促血管生成。鑒于上述觀察轉錄因子BHLHE41起到了足夠的作用在偏振引發+ CD4 + T細胞,作者下一個試圖評估其必要的角色在這些T細胞,發現消融的BHLHE41 CRISPRCas9系統無法消除引發表達CD4 + T細胞,在人類和自適應傳輸BHLHE41-knockout CD4 + T細胞沒有逆轉腫瘤的生長和鼠標生存相比,對照組的爭奪(數據沒有顯示)。因此,這些結果表明BHLHE41在編程表達IL-8的CD4+ T細胞中發揮了充分而非必要的作用。


    圖4. 產生IL -8的T細胞的轉錄和功能鑒定


    5、惡性膠質瘤中主要由腫瘤細胞、髓細胞和T細胞表達的IL-8增強了血管免疫微環境的抑制特性
           越來越多的臨床證據表明,血漿中IL-8的表達水平與腫瘤負荷呈正相關,但與ICB治療的臨床結果呈負相關,這導致了針對IL-8和/或其受體CXCR1/CXCR2的潛在癌癥治療方向。然而,由于嚙齒動物缺乏IL-8基因,IL-8在體內的功能,特別是作為腫瘤發生的關鍵免疫調節因子,尚不清楚。作者首先研究了惡性膠質瘤中IL-8產生的細胞來源。對人GBM的snRNA-seq數據分析顯示,IL8的表達主要局限于腫瘤細胞、髓細胞和T細胞(圖5A)。此外,作者遵循之前的策略,生成了IL-8人源化(IL8- hu)小鼠品系,其中將含有整個人類IL-8基因位點和上下游調控元件的~160 kb人類BAC克隆(RPL11-997L11)插入小鼠9號染色體的基因間區(圖5B)。與先前研究的觀察結果一致,在外觀、體重、壽命、生育能力和淋巴器官免疫細胞群方面,幼稚的IL8-Hu小鼠與WT對照小鼠沒有區別(數據未顯示)。然后,作者將表達熒光素酶的GL261細胞注射到小鼠顱內,以模擬人類膠質母細胞瘤。與WT組相比,移植GL261的IL8-Hu小鼠腫瘤大小明顯增大,壽命明顯縮短(圖5C)。通過IHC和H&E染色對IL8-Hu小鼠腫瘤組織進行組織學檢查,發現腫瘤壞死區域和血管密度增加,且常伴有IL-8陽性多形核白細胞(PMN)浸潤,其模式與人GBM腫瘤組織非常相似(圖5D)。更重要的是,IL-8在IL-8- hu小鼠腫瘤中CD45+ CD3骨髓細胞和CD4+ T細胞中的表達顯著升高,這些小鼠IL-8+ CD4+ T細胞轉錄反映了人類表達IL-8的CD4+ T細胞(圖5E)。此外,與對照組相比,IL8-Hu小鼠的腫瘤浸潤性CD4+和CD8+ T細胞攜帶更多的衰竭標志物PD-1和TIM-3(圖5F)。因此,與WT小鼠相比,作者新生成的IL8-Hu小鼠品系更適合模擬人類膠質瘤,在膠質瘤中,人IL-8的生理表達能夠再現腫瘤生長加速和血管生成,并增強骨髓源性抑制細胞在TME中的募集。


    圖5. IL-8人源化小鼠品系能夠更好地模擬膠質瘤患者的TME


    6、阻斷IL-8-CXCR1/CXCR2軸與抗pd -1免疫治療協同作用
           作者研究了阻斷IL-8-CXCR1/ CXCR2軸是否能增強抗pd -1在惡性膠質瘤中的作用。藥物抑制劑reixin抑制CXCR1和CXCR2,可顯著減緩IL8-Hu和WT小鼠的腫瘤生長,提高生存率(圖6A和6B)。流式細胞術評估顯示,修復素治療不僅消除了抗pd -1誘導的CD11bhiGr1hi MDSCs和CD11bhiGr1mid MDSCs的基礎水平,也消除了腫瘤中CD11bhiGr1hi MDSCs和CD11bhiGr1mid MDSCs的基礎水平,但在IL8-Hu小鼠和WT小鼠的脾臟中沒有(圖6C、6D)。重要的是,PD-1的阻斷與修復素一起,進一步將Tim-3和PD-1在T細胞中的表達降低到最低水平,盡管浸潤腫瘤的T細胞總數沒有顯著變化(圖6E)。因此,作者的研究結果為以下觀點提供了證據:通過靶向CXCR1和CXCR2隔離MDSCs可以利用抗pd -1治療膠質瘤的療效。接下來,作者通過檢查IL-8的中和是否具有類似的效果來擴展作者的研究。由于人原發性膠質母細胞瘤細胞也高水平表達IL-8,作者通過將IL-8和熒光素酶雙表達的GL261細胞注射到IL8-Hu小鼠中,然后用PD-1和/或IL-8阻斷抗體對其進行順序處理,嚴格模擬人膠質母細胞瘤(圖6F)。接受抗IL-8抗體的小鼠腫瘤大小明顯減小,生存率明顯提高(圖6G和6H)。值得注意的是,與同型對照組相比,PD-1和IL-8的雙重阻斷顯著延長了中位生存期18天(圖6H)。鑒于作者之前的數據顯示抗pd -1抗體在IL8-Hu小鼠中增加了全身IL-8,并且IL-8能夠促進腫瘤血管生成,作者通過CD31免疫組化染色對膠質瘤腫瘤的微血管進行了組織學評估。與對照小鼠相比,接受抗pd -1抗體治療的荷瘤小鼠IL-8 - hu微血管密度顯著升高,而抗IL-8治療后微血管密度大大降低(圖6I)??傊?,作者的研究結果表明,IL-8的中和相當于其受體CXCR1和CXCR2的阻斷,通過消除抑制性MDSCs來增強T細胞介導的抗腫瘤免疫。


    圖6. 阻斷IL-8-CXCR1/CXCR2軸可發揮抗PD-1的作用


    7、阻斷IL-8重編程膠質瘤腫瘤微環境
           髓系細胞,包括單核細胞來源的巨噬細胞(MDMs)、小膠質細胞和MDSCs,構成膠質瘤TME的主要非腫瘤性細胞成分。41,42接下來,作者進行了scRNA-seq分析,以探討在單獨阻斷PD-1和IL-8以及聯合阻斷的情況下膠質瘤TME的變化。如圖7A-7C所示,對腫瘤中CD45+細胞的scRNA-seq數據進行無監督聚類分析,鑒定出10種細胞亞型,包括小膠質細胞、T細胞、MDM、M-MDSC、G-MDSC、樹突狀細胞(DC)、活化DC、漿細胞樣DC (pDC)、肥大細胞和B細胞。與作者流式細胞術觀察的結果一致,與WT小鼠相比,更多的MDSCs浸潤到IL8-Hu的TME中,抗pd -1治療進一步特異性增強了M-MDSCs的浸潤,而IL-8中和消除了腫瘤浸潤的M-MDSCs,無論是否存在抗pd -1抗體(圖7D和7E)。此外,研究發現M-MDSCs容易產生活性氧,例如脂肪酸氧化相關基因Alox12e、Alox15和Pla2g3的選擇性表達,以及超氧陰離子產生相關基因Prg3、Tafa4和Nox1(圖7F),這突出了G-MDSCs和M-MDSCs在協調腫瘤免疫抑制微環境方面的不同作用(TIME)。此外,據報道,促進TIME的腫瘤浸潤性肥大細胞幾乎被IL-8中和耗盡(圖7D)。腫瘤相關巨噬細胞(tam),包括MDMs和小膠質細胞,在WT和IL8-Hu小鼠的膠質瘤TME中都大量富集(圖7D)。為了進一步探索IL-8中和對tam的潛在影響,作者將MDM集群重新劃分為四個亞集群,包括亞集群1(2型樣巨噬細胞,m2樣)、亞集群2(抗腫瘤)、亞集群3(抗血管生成)和亞集群4(圖7G和7H)。作者發現,接受非抗IL-8治療的小鼠的腫瘤浸潤性MDM細胞大部分(80%)由具有免疫抑制和血管生成相關基因的m2樣巨噬細胞組成(圖7H和7I)。相比之下,接受抗IL-8單藥或聯合治療的小鼠MDM細胞主要由亞群3、抗血管生成巨噬細胞組成(圖7H、7I)。因此,作者的研究結果表明,IL-8的中和通過將m2樣巨噬細胞轉換為抗血管生成巨噬細胞來重新編程膠質瘤中的MDMs。同樣,膠質瘤駐地小膠質細胞被重新分為四種亞型,包括靜息小膠質細胞、抑制性小膠質細胞、IL-13+細胞和炎性小膠質細胞(圖7J和7K)。最引人注目的是,IL-8抑制有效地消融了具有免疫抑制和血管生成相關基因的抑制性小膠質細胞(圖7I)。綜上所述,作者的上述數據表明,IL-8阻斷可以通過消除MDSCs和肥大細胞以及tam的重新填充,將膠質瘤TME從促腫瘤狀態重塑為抗腫瘤狀態,從而與ICB治療協同產生整體抗腫瘤免疫反應。


    圖7. 阻斷IL-8可重編程腫瘤免疫微環境


    結論
           總之,作者定義了一個治療上可靶向的趨化軸,并且靶向IL-8/CXCR1/ CXCR2軸聯合ICB可能使膠質瘤患者受益。

    實驗方法
    細胞懸浮液的制備、scRNA-seq、血細胞計數、T細胞體外分化、流式細胞術細胞表面和細胞內細胞因子染色、免疫熒光(IF)和免疫組化染色、ChIP-qPCR、ELISA、RNA測序、血管形成實驗
    參考文獻
    Liu H, Zhao Q, Tan L, Wu X, Huang R, Zuo Y, Chen L, Yang J, Zhang ZX, Ruan W, Wu J, He F, Fang Y, Mao F, Zhang P, Zhang X, Yin P, Yan Z, Xu W, Lu H, Li Q, Liang M, Jia Y, Chen C, Xu S, Shi Y, Ping YF, Duan GJ, Yao XH, Han Z, Pang T, Cui Y, Zhang X, Zhu B, Qi C, Wang Y, Lv SQ, Bian XW, Liu X. Neutralizing IL-8 potentiates immune checkpoint blockade efficacy for glioma. Cancer Cell. 2023 Apr 10;41(4):693-710.e8. doi: 10.1016/j.ccell.2023.03.004. Epub 2023 Mar 23. PMID: 36963400.


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