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  • 肺泡巨噬細胞外泌體分泌的Ficolin B通過cGAS-STING信號通路通過鐵死亡加劇博來霉素誘導的肺損傷

    欄目:最新研究動態 發布時間:2024-02-26
    本研究表明,由AMs外泌體轉運的Fcn B通過cGAS-STING信號通路促進肺上皮細胞鐵死亡,從而加劇了BLM誘導的肺損傷......

           多年來,肺損傷一直危害著全球人類的健康,因此對肺損傷的發病機制進行探索和及時干預是非常必要的。Ficolin B(Fcn B)是一種可識別多種配體的識別分子,在介導細胞周期、免疫反應和肺組織穩態中發揮著重要作用。然而,Fcn B在博萊霉素(BLM)誘導的肺損傷中的作用尚不明確。本研究旨在探討Fcn B在博萊霉素誘導的肺損傷中的來源及其機制。研究選取WT、Fcna-/-和Fcnb-/-小鼠構建BLM誘導的肺損傷模型。利用肺上皮細胞構建BLM誘導的細胞模型。臨床數據表明,間質性肺?。↖LD)患者血漿中的 M-ficolin(Fcn B的同源物)含量升高。在小鼠模型中,巨噬細胞衍生的Fcn B加劇了BLM誘導的肺損傷和肺纖維化。Fcn B進一步促進了自噬和鐵死亡的發展。值得注意的是,細胞實驗結果顯示,BLM誘導的AMs外泌體轉運的Fcn B通過激活cGAS-STING通路加速了肺上皮細胞的自噬和鐵死亡。與此相反,3-甲基腺嘌呤(3-MA)通過抑制自噬依賴性鐵死亡,逆轉了BLM誘導的AMs外泌體中的Fcn B對肺上皮細胞損傷的促進作用。同時,在BLM誘導的小鼠模型中,BLM誘導的AMs外泌體分泌的Fcn B的干預作用通過鐵死亡促進了肺損傷和肺纖維化。綜上所述,本研究表明,由AMs外泌體轉運的Fcn B通過cGAS-STING信號通路促進肺上皮細胞鐵死亡,從而加劇了BLM誘導的肺損傷。本文于2023年8月發表于cell death & disease》,IF=9。
    技術路線



    主要實驗結果

    1.巨噬細胞來源的Fcn B加重BLM誘導的肺損傷和纖維化

           首先,作者的臨床數據顯示,間質性肺?。↖LD)患者血漿中L-ficolin(Fcn A的同源物)的濃度與健康人相比無明顯差異,而M-ficolin(Fcn B的同源物)的濃度則明顯升高(圖1A)。為了探討Fcn B對肺損傷的影響,用BLM刺激WT、Fcna-/-和 Fcnb-/-小鼠。在BLM誘導前,WT、Fcna-/-和Fcnb-/-小鼠的存活率均為100%。然而,BLM誘導的WT小鼠的存活率明顯降低,而BLM誘導的Fcnb-/-(而非 Fcna-/-)小鼠的存活率則略有降低(圖1B)。HE染色證明,BLM誘導后小鼠肺泡結構受到不同程度的損傷,肺泡壁增厚并伴有炎癥浸潤,表明肺損傷模型構建成功。與WT+BLM 組相比,Fcnb-/-+BLM 組的肺泡結構相對完整,炎癥浸潤最少(圖1C)。代表組織纖維化的Masson染色顯示,只有Fcnb-/-+BLM組的肺間質膠原纖維沉積量少于 WT+BLM組(圖1D)。同樣,Fcnb-/-+BLM組BALF中的總蛋白濃度和肺組織中的羥脯氨酸濃度也明顯低于WT+BLM 組(圖1E、F)。此外,Fcnb-/-+BLM組肺組織中α-SMA的表達也明顯低于WT+BLM組(圖1E,F)。此外,與WT+BLM組相比,Fcnb-/-+BLM組小鼠肺中α-SMA的表達明顯下調(圖1G)。BLM誘導后,WT和Fcna-/-小鼠肺部和血液中Fcn B表達的增加主要來自巨噬細胞(部分來自中性粒細胞)(圖1H,I)。與BLM誘導的WT小鼠相比,BLM誘導的Fcnb-/-小鼠肺中巨噬細胞數量明顯減少。這些結果證明巨噬細胞衍生的Fcn B加重了BLM誘導的肺損傷和肺纖維化。


    圖1:來自巨噬細胞的Fcn B加重了BLM誘導的肺損傷和纖維化


    2.Fcn B促進BLM誘導肺損傷模型中的自噬和鐵死亡

           接下來,為了探索Fcn B加重肺損傷的原因,作者檢測了小鼠模型中與自噬和鐵死亡相關的標志物水平。與WT+BLM組相比,Fcna-/-+BLM組和Fcnb-/-+BLM組的肺組織中LC3II/LC3I、Beclin1和ATG7的表達減少,而p62的表達增加(圖2A)。與WT+BLM組相比,Fcnb-/-+BLM組肺和血清中MDA和Fe2+濃度降低,GSH濃度顯著升高(圖2B)。然后檢測肺組織的ROS水平,結果顯示Fcnb-/-+BLM組明顯低于WT+BLM 組(圖2C)。此外,與WT+BLM組相比,Fcnb-/-+BLM組肺組織中GPX4、SLC7A11、FTH1、FTL1表達明顯增加,NCOA4表達減少(圖2D、E)。因此,這些結果表明,在BLM誘導的肺損傷模型中,Fcn B可以促進自噬和死亡。

    圖2: Fcn B促進BLM誘導的肺自噬和鐵死亡


    3.BLM誘導的AMs外泌體加速肺上皮細胞中Fcn B的表達、自噬和鐵死亡

           作者應用外泌體抑制劑GW4869探討其對AMs外泌體功能的影響。BLM誘導后,AMs中Fcn B的mRNA表達上調(圖3A)。在Transwell細胞培養系統中,添加GW4869可抑制外泌體從上腔BLM誘導的AMs向下腔BLM誘導的肺上皮細胞的分泌和遷移(圖3B)。當BLM處理過的肺上皮細胞與BLM處理過的AMs共同培養時,Fcn B的轉錄顯著增加。不幸的是,使用GW4869后這一趨勢被逆轉(圖3C)。隨后,Western印跡結果顯示,BLM處理過的肺上皮細胞與BLM處理過的AMs共同培養后,LC3II/LC3I、Beclin1和ATG7的表達上調,p62的表達下調。然而,添加GW4869可逆轉這些變化(圖3D, E)。生化檢測進一步表明,與BLM處理過的AMs共同培養會顯著增加BLM處理過的肺上皮細胞中MDA和Fe2+ 的濃度,同時降低GSH的濃度。然而,GW4869的存在降低了MDA和Fe2+的濃度,但增加了GSH的濃度(圖3F,G)。此外,BLM處理的肺上皮細胞與BLM處理的AMs共培養后,ROS水平和死亡率也明顯升高,但在GW4869條件下則有所下降(圖3H,I)。同時作者發現,BLM處理的肺上皮細胞與BLM處理的AMs共同培養后,GPX4、SLC7A11、FTH1和FTL1的表達明顯下調,而NCOA4的表達明顯上調。然而,施用GW4869后,上述結果發生了逆轉(圖3J,K)。這些結果表明,AMs中Fcn B的調節可能是參與自噬和鐵死亡的一種機制,從而減輕BLM誘導的肺上皮細胞損傷。

    圖3:BLM誘導的AMs外泌體增加Fcn B表達,促進肺上皮細胞自噬和鐵死亡


    4.BLM誘導的AMs通過外泌體轉運的Fcn B介導肺上皮細胞自噬和鐵死亡

           為了研究AMs與Fcn B之間的聯系,作者提取了外泌體并進行了一系列表征。NTA結果顯示,大多數外泌體的大小在40到160 nm之間(圖4A)。TEM圖像顯示,外泌體通常呈碟形,呈單一分布(圖4B)。Western 印跡進一步顯示,外泌體中表達了特定的標記物CD9、CD63和CD81(圖4C)。PKH67標記的外泌體被肺上皮細胞成功吸收并分布在細胞核周圍(圖4D)。經BLM處理的肺上皮細胞與經BLM處理的AMs衍生的外泌體共培養后,Fcn B的mRNA表達上調(圖4E)。BLM處理的肺上皮細胞與轉染了oe-Fcnb的AMs衍生的外泌體共培養后,Fcn B的mRNA表達有更明顯的增加。用si-Fcnb轉染肺上皮細胞并用BLM處理后,Fcn B的mRNA表達明顯受到抑制。然而,與轉染了oe-Fcnb并經BLM處理的AMs衍生的外泌體共同培養可逆轉這種效應(圖4F)。隨后的Western印跡結果顯示,轉染si-Fcnb可顯著下調BLM處理的肺上皮細胞中LC3II/LC3I、Beclin1和ATG7的表達,并上調p62的表達。然而,與轉染了oe-Fcnb和BLM處理過的AMs衍生外泌體共同培養卻得到了相反的結果(圖4G,H)。此外,生化檢測結果表明,與轉染了oe-Fcnb和BLM處理過的AMs衍生外泌體共培養后,si-Fcnb對MDA和Fe2+濃度的抑制作用以及對BLM處理過的肺上皮細胞中GSH的促進作用被逆轉(圖4I)。同樣,與轉染oe-Fcnb 和BLM處理的AMs衍生外泌體共培養后,轉染si-Fcnb和BLM處理的肺上皮細胞的ROS水平和死亡率顯著增加(圖4J,K)。Western 印跡結果顯示,在 BLM 處理的肺上皮細胞中,si-Fcnb轉染可明顯促進 GPX4、SLC7A11、FTH1和FTL1的表達,抑制NCOA4的表達。然而,當與轉染了oe-Fcnb和BLM處理過的AMs衍生的外泌體共同培養時,這一趨勢發生了逆轉(圖4L,M)。這些結果表明,BLM誘導的AMs 通過外泌體轉運的Fcn B介導了肺上皮細胞的自噬和鐵死亡。

    圖4:由BLM誘導的AMs轉運的Fcn B外泌體有助于肺上皮細胞自噬和鐵死亡


    5.BLM誘導的AMs外泌體中的Fcn B通過cGAS-STING通路促進肺上皮細胞自噬和鐵死亡

           當用BLM誘導si-Fcnb或si-cGAS轉染的肺上皮細胞時,cGAS、LC3II/LC3I、Beclin1和ATG7的表達下調,STING的磷酸化也降低,而p62的表達上調。然而,當它們與轉染oe-Fcnb和BLM誘導的AMs共同培養時,cGAS、LC3II/LC3I、Beclin1和ATG7的表達上調,STING的磷酸化也增加,而p62的表達下調(圖5A-C)。進一步研究發現,BLM誘導后,si-Fcnb或si-cGAS轉染的肺上皮細胞中MDA和Fe2+的水平降低,而GSH的水平升高。然而,將轉染oe-Fcnb的AMs與BLM誘導的AMs共同培養后,MDA和Fe2+的水平升高,而GSH的水平則相反(圖5D,E)。同樣,當轉染了si-Fcnb或si-cGAS的肺上皮細胞被BLM誘導時,ROS水平和細胞死亡率均下降。相反,當它們與轉染oe-Fcnb和BLM誘導的AMs共同培養時,ROS水平和細胞死亡率均升高(圖5F,G)。鐵死亡相關蛋白的檢測發現,當轉染si-Fcnb或si-cGAS的肺上皮細胞被BLM誘導時,GPX4、SLC7A11、FTH1和FTL1的表達上調,NCOA4的表達下調。不幸的是,當它們與轉染oe-Fcnb和BLM誘導的AMs共培養時,GPX4、SLC7A11、FTH1和FTL1的表達下調,而NCOA4的表達上調(圖5H,I)。這些結果表明,BLM誘導的AMs外泌體中的Fcn B促進了cGAS-STING通路介導的肺上皮細胞自噬和鐵死亡。

    圖5:cGAS-STING通路介導的肺上皮細胞自噬和鐵死亡,由BLM誘導的AMs外泌體的Fcn B促進


    6.BLM誘導的AMs外泌體中的Fcn B通過cGAS-STING途徑促進的肺上皮細胞鐵死亡是自噬依賴性的

           為進一步闡明肺上皮細胞鐵死亡與自噬的關系,將si-cGAS轉染和 BLM誘導的肺上皮細胞與不同AMs的外泌體共同培養,并結合自噬抑制劑3-MA進行研究。si-cGAS轉染的肺上皮細胞和BLM誘導的肺上皮細胞的線粒體損傷均有所減輕。當它們與轉染oe-Fcnb和BLM處理過的AMs外泌體共同培養時,線粒體損傷加劇。然而,使用3-MA逆轉了oe-Fcnb轉染對細胞造成的損傷,細胞中的大多數線粒體保持正常狀態(圖6A)。此外,3-MA還降低了BLM誘導的AMs外泌體中的Fcn B對si-cGAS轉染細胞和BLM誘導的肺上皮細胞的自噬促進作用,表現出 LC3II/LC3I、Beclin1和ATG7表達減少,p62表達增加(圖6B)。接著,轉染oe-Fcnb和BLM處理的AMs外泌體促進了si-cGAS轉染和BLM處理的肺上皮細胞中MDA和Fe2+的積累,并抑制了GSH的合成,而添加3-MA則顯示出相反的效果(圖6C,D)。此外,si-cGAS轉染和BLM處理的肺上皮細胞與oe-Fcnb轉染和BLM處理的AMs外泌體共培養后,GPX4、SLC7A11、FTH1和FTL1的表達下調,NCOA4的表達上調,但這些變化在3-MA條件下相反(圖6G,H)。這些結果表明,抑制自噬可通過cGAS-STING 通路減輕BLM誘導的AMs外泌體中的Fcn B促進的肺上皮細胞鐵死亡。

    圖6:抑制自噬可通過cGAS-STING通路減輕BLM誘導的AMs外泌體中的Fcn B 促進的肺上皮細胞鐵死亡


    7.在BLM誘導的小鼠模型中,從AMs外泌體轉運的Fcn B通過鐵死亡促進肺損傷和纖維化

           為了研究AMs外泌體衍生的Fcn B在體內的功能,WT和Fcnb-/-小鼠受到BLM刺激后,尾靜脈注射轉染oe-Fcnb和BLM誘導的AMs外泌體進行干預。HE 染色顯示,與WT+BLM組相比,Fcnb-/-+BLM組的肺泡結構更完整,炎癥浸潤更少。然而,與Fcnb-/-+BLM+Exooe-NC組相比,Fcnb-/-+BLM+Exooe-Fcnb組的肺泡結構不完整,炎癥浸潤增加(圖7A)。Masson染色還顯示,Fcnb-/-+BLM+Exooe-Fcnb組的肺間質纖維化增加(圖7B)。此外,我們還發現Fcnb-/-+BLM+Exooe-Fcnb組比Fcnb-/-+BLM+Exooe-NC組肺組織BALF總蛋白濃度增加、羥脯氨酸和α-SMA表達增加(圖7C-E)。此外,與Fcnb-/-+BLM+Exooe-NC 組相比,Fcnb-/-+BLM+Exooe-Fcnb組肺部組織中受損線粒體數量增加(圖8A)。此外,與Fcnb-/-+BLM+Exooe-NC組相比,Fcnb-/-+BLM+Exooe-Fcnb組肺中LC3II/LC3I、Beclin1和ATG7的表達明顯上調,p62的表達明顯下調(圖8B)。生化檢測顯示,與Fcnb-/-+BLM+Exooe-NC組相比,Fcnb-/-+BLM+Exooe-Fcnb組肺組織和血清中MDA和Fe2+濃度顯著升高,而GSH濃度降低(圖8C,D)。流式細胞術顯示,Fcnb-/-+BLM+Exooe-Fcnb組肺組織中的ROS水平高于Fcnb-/-+BLM+Exooe-NC組(圖8E)。此外,與Fcnb-/-+BLM+Exooe-NC組相比,Fcnb-/-+BLM+Exooe-Fcnb組肺組織中GPX4、SLC7A11、FTH1和FTL1的表達顯著下調,而NCOA4的表達上調(圖8F,G)。此外,Fcnb-/-+BLM+Exooe-Fcnb組中cGAS的表達和STING的磷酸化明顯高于Fcnb-/-+BLM+Exooe-NC組(圖8H)。這些結果表明,在BLM誘導的小鼠模型中,從AMs外泌體轉運的Fcn B通過鐵死亡促進了肺損傷和肺纖維化。

    圖7:AMs外泌體轉運的Fcn B有助于BLM誘導的小鼠模型的肺損傷和肺纖維化


    圖8:AMs外泌體轉運的Fcn B促進了BLM誘導的小鼠的鐵死亡


    結論
           總之,這是第一篇研究Fcn B在BLM誘導的肺損傷中的作用的報道,它表明由AMs外泌體轉運的Fcn B可通過cGAS-STING途徑促進肺上皮細胞鐵凋亡,從而加重BLM誘導的肺損傷(圖9)。


    圖9


    參考文獻
    Wu, X., Jiang, Y., Li, R. et al. Ficolin B secreted by alveolar macrophage exosomes exacerbates bleomycin-induced lung injury via ferroptosis through the cGAS-STING signaling pathway. Cell Death Dis 14, 577 (2023). https://doi.org/10.1038/s41419-023-06104-4
    常規分子實驗
    外泌體的提取和鑒定、HE染色、Masson染色、生化檢測、蛋白質印跡檢測、RT-qPCR
    細胞實驗
    細胞培養和處理、流式細胞術
    動物模型及病理實驗
    BLM誘導肺損傷模型的構建與干預


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