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  • tRF-Gln-CTG-026減少全局蛋白合成以改善肝損傷

    欄目:最新研究動態 發布時間:2024-02-01
    本研究證實tsRNA可改善肝損傷通過利用NSun2的缺失作為tsRNAs發生模型......

           tRNA來源的小RNA(tsRNAs)是壓力應激的產物,對應激反應和損傷調節有相當大的影響。然而,tsRNAs是否可以改善肝損傷仍不清楚。在這里,本研究證實tsRNA可改善肝損傷通過利用NSun2的缺失作為tsRNAs發生模型。機制上,NSun2的缺失降低了tRNAs的m5U修飾和m5C修飾,導致產生大量的tsRNAs,特別是tRF-1s類。通過進一步篩選,作者發現tRF-Gln-CTG-026(tG026)是最佳的tRF-1,它通過削弱TSR1(pre-rRNA加工蛋白TSR1同源物)與pre-40S核糖體之間的關聯,抑制全局蛋白合成,從而改善肝損傷。本文于2023年4月發表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》IF:39.3期刊上。
    技術路線


    主要實驗結果
    1、在體外構建loss-of-NSun2作為tsRNA發生模型以緩解損傷

           首先對小鼠進行肝損傷誘導,驗證tsRNAs是否參與肝損傷和修復(圖1a)。結果發現肝損傷小鼠中tsRNA的數量增加(圖1b),表明tsRNA的產生與肝損傷有關。為進一步研究tsRNA與肝損傷的關系,建立tsRNA生成模型。通過篩選HL-7702細胞系中的三種tRNA修飾酶(NSun2、Mettl1和Dnmt2),在低損傷脅迫下,與ME-KD(Mettl1敲低)和DN-KD(Dnmt2敲低)相比,NSun2敲低(NS-KD)可導致增殖增加(圖1c, e);此外,在高(致死)應激下,NSun2敲低可提高細胞存活率(圖1d, e)。NS-KD也增加了H2O2處理下的細胞增殖(圖1f)。相反,使用不同的高強度應激誘導劑(CCl4、對乙酰氨基酚和油酸混合物)并測量細胞存活率。結果顯示,NS-KD提高了應激損傷下的細胞存活率(圖1g, i)。正如預期的,NS-KD僅在壓力下起作用,在基礎條件下,NS-KD不影響細胞增殖(圖1h, i)??傊?,這些結果表明,肝損傷與tsRNA的產生有關,NS-KD可促進細胞增殖和存活,但不會改變體外壓力下的細胞遷移。


    圖1 NS-KD改善細胞損傷。


    2、NS-KD在體內改善肝損傷
           如上所述,NSun2的缺失是研究tsRNAs的一個合適模型,可以改善細胞在應激下的增殖和存活。因此,作者通過CRISPR/Cas9介導的NSun2基因第2外顯子56 bp的缺失,產生了NS-KO小鼠(圖2a)。在沒有應激損傷的情況下,NS-KO沒有引起肝臟形態學和病理生理的異常(圖2b),這表明NS-KO和由此產生的tsRNAs在沒有應激的情況下都沒有功能。通過腹腔注射(i.p) CCl4模擬短期或長期肝損傷(圖2c),證明NS-KO對應激損傷和肝損傷有反應。單次注射CCl4后第3天,肝臟出現壞死和炎癥;第27天,觀察到纖維化;NS-KO小鼠的壞死程度低于野生型小鼠(圖2d)。隨后檢測了單次或多次注射CCl4后的血液生化指標。丙氨酸轉氨酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)和堿性磷酸酶(ALP)濃度在單次注射CCl4后第3天達到最大值,表明肝細胞損傷相當嚴重,隨后在重復注射CCl4后第27天降至相對正常水平;NS-KO小鼠的3項指標均低于WT小鼠,提示NS-KO小鼠肝損傷輕微(圖2e, f)。此外,與WT小鼠相比,NS-KO小鼠在肝損傷第3天增殖肝細胞數量明顯增加(圖2g);相反,NS-KO小鼠的干細胞凋亡顯著下降(圖2h)。在應激狀態下,促增殖、促生存和抗炎相關基因的表達增加,而抗增殖、抗生存和抗炎相關基因的表達受到抑制(圖2i)??傊?,在短期和長期肝損傷中,觀察到NS-KO小鼠的肝損傷比WT小鼠輕,表明NSun2缺失可減輕體內肝損傷。


    圖2 NS-KO改善肝壞死、再生和活體存活


    3、NS-KO衍生的小RNA可改善應激下的增殖和存活
           作者假設,NS-KO可通過NS-KO衍生的小RNA防止肝損傷。為驗證這一假設,首先敲除HL-7702細胞系中的NSun2,將沒有酶活性的突變體NSun2(K190M或C271A)轉染到HL-7702細胞系中,并細胞毒性刺激。EdU和細胞增殖實驗表明,只有WT NSun2能抑制NSun2敲除引起的細胞增殖促進(圖3a、b、d),而NSun2突變體(K190M或C271A)不能。同樣,只有WT NSun2 能逆轉NS-KD引起的細胞活力增加,而NSun2突變體則不能(圖3c, d)。這些結果表明,NSun2的缺失主要通過tRNA甲基轉移酶活性的喪失來促進細胞在脅迫下的增殖和存活。在NS-KO細胞中,tRNA表達降低(圖3e)。變異最顯著的修飾是tRNA m5U和之前描述的m5C,在NS-KO樣本中,兩者都顯著降低(圖3f, g)。
           上述發現表明,NS-KO通過失去其甲基轉移酶活性,同時減少tRNA m5U和m5C修飾來發揮作用。隨后研究NS-KO衍生的小RNA是否足以改善細胞在壓力下的增殖和存活。從WT和NS-KO小鼠體內分離出14-50 nt和50-100 nt的肝臟RNA片段(圖3h)。由于tsRNAs的大小通常小于50 nt,所以將14-50 nt的RNA視為含tsRNAs的RNA,將50 - 100 nt的RNA視為非tsRNAs和陰性對照。EdU表明,轉染NS-KO小鼠的14-50 nt RNA片段比轉染WT小鼠的片段更能促進細胞增殖(圖3i),而50 - 100 nt的RNA不改變兩組的增殖。CCK-8實驗顯示,來自NS-KO小鼠的14-50 nt RNA片段,而不是來自WT小鼠的14-50 nt RNA片段和來自兩種小鼠的50-100 nt RNA片段,增加損傷后的細胞存活率(圖3j)。因此,NS-KO來源的14-50 nt RNA片段在促進損傷后細胞增殖和存活方面發揮了重要作用。


    圖3 NS-KO衍生的tsRNAs減輕肝損傷


    4、tRF-1是NS-KO的核心產物
           為全面分析tsRNAs的代謝特征,分析WT和NS-KO小鼠不同應激損傷后tsRNAs的差異,tsRNA-seq鑒定到841個未記錄的tsRNA和104個記錄在tRFdb數據庫中的已知tsRNA(圖4a)。NS-KO小鼠的tsRNAs在整個損傷過程中保持相對較高的水平,而tsRNAs在WT D3時達到峰值(圖4b)。因此,作者猜想在整個CCl4重復注射過程中,第3天是肝細胞增殖和tsRNA生成最活躍的時間(圖2g, 4b),NS-KO小鼠可能具有與WT D3小鼠相似的“促修復tsRNA模式”。
           在進一步分析WT和NS-KO小鼠肝損傷不同階段的tsRNAs圖譜后,發現與其他tsRNAs相比,NS-KO小鼠的tRF-1s突然增加。在所有肝損傷時間點,NS-KO組的tRF-1s都明顯多于WT組,但WT組只在第3天有所增加(圖4c,d)。對tRF-1s的詳細分析顯示,tRF-1s的長度主要在14到23 nt之間(圖4d)??偟膩碚f,NSun2缺失主要在肝臟中產生14-23 nt的tRF-1s。此外,NS-KO小鼠的tRF-1表達高于WT小鼠,而其他類型的tsRNAs在NS-KO小鼠中的表達低于WT小鼠(圖1e)??傊?,tRF-1是NS-KO阻止肝損傷和響應壓力應激的核心產物。


    圖4 tsRNA-seq顯示應激條件下WT和NS-KO小鼠中tRF-1的特征


    5、篩選的tRF-1在體外和體內對肝損傷有拯救作用
           如上所述,肝損傷的副產物主要是tRF-1s。為闡明tRF-1s是否可以作為治療肝損傷的一種潛在方法,人工合成了圖4所示的68個tRF-1s。用硫代磷酸酯(PS)、2'-O-甲基(2'-OMe)和膽固醇修飾tRF-1s,以提高其穩定性和體內轉染效率(圖5a)。然后,將人工合成的 tRF-1s 轉染到HL-7702細胞和原代人類肝細胞(PHH)中,并在體外和體內驗證它們的功能。EdU試驗表明,合成的tRF-1s能促進細胞增殖(圖5b)。CCK-8檢測顯示,過表達tRF-1s后細胞活力提高(圖5c)。在PHH中,也得到了一致的結果(圖5d,e)。為驗證改良合成的tRF-1s在體內的功能,給肝損傷小鼠靜脈注射tRF-1s。首先,選擇了一種tRF-1(tRF-Met-CAT-049)來測定小RNA在體內的代謝時間過程。結果顯示,tRF-Met-CAT-049在注射后第1天開始表達,第3天達到峰值。因此,只注射一次tsRNAs就治愈了肝損傷小鼠(圖5f-i),因為注射的RNAs可以在這段時間內保持高水平表達。之后,進一步從68個潛在的tRF-1中篩選出最有效的tRF-1。作者發現,篩選到的tG026在體內可以改善肝損傷(圖5j, k),NS-KO后tG026的表達增加(圖5l, m)。綜上所述,通過篩選,tG026可以改善上述肝損傷。


    圖5篩選的tG026促進了損傷后細胞的增殖和存活


    6、tG026抑制TSR1與18S rRNA的相互作用以降低全局蛋白質合成
           為探索tG026的潛在機制,進行RNA pull-down-LC-MS/MS檢測,以篩選與tG026相互作用的蛋白質(圖6a)。在尋找HL-7702和AML12細胞系中與tG026 相互作用的共同蛋白后(圖6b),選擇參與Pre-40S核糖體組裝的前rRNA處理蛋白TSR1同源物(TSR1)進行后續實驗。作者推測tG026可能會調控核糖體。通過RNA pull-down,驗證了TSR1和tG026在兩種細胞系中的相互作用(圖6c,d)。tG026抑制TSR1與核糖體之間的相互作用,因為18S rRNA是核糖體復合物的重要組成部分(圖6e, f)。最后,OP-Puro incorporation 實驗證實tG026抑制全局蛋白質合成(圖6g, h)。


    圖6 tG026抑制TSR1與18S rRNA的相互作用以降低GPS


           總而言之,缺失NSun2可減輕注射CCl4對肝臟造成的損傷。機制上,NSun2 的缺失會減少m5U和m5C的修飾。因此,tRNA變得不穩定并產生tsRNA,尤其是tRF-1。通過進一步篩選實驗,發現tG026通過與TSR1相互作用,抑制了TSR1與18S rRNA之間的關聯,從而減少了全局蛋白質合成,減輕肝損傷。


    圖7 tG026參與肝損傷的機制模型。


    實驗方法
    肺損傷小鼠建模,轉染,細胞增殖實驗,細胞活力實驗,WB,劃痕實驗,HE染色,免疫熒光,免疫組化,qRT-PCR,天狼星紅染色,LC-MS檢測tRNA修飾,small RNA測序,人工合成tsRNA和體內注射,肝部分切除術(PH),RNA pull-down,蛋白組學分析,RIP,體外和體內檢測蛋白總體水平
    參考文獻
    Ying S, Li P, Wang J, Chen K, Zou Y, Dai M, Xu K, Feng G, Zhang C, Jiang H, Li W, Zhang Y, Zhou Q. tRF-Gln-CTG-026 ameliorates liver injury by alleviating global protein synthesis. Signal Transduct Target Ther. 2023 Apr 3;8(1):144. doi: 10.1038/s41392-023-01351-5. PMID: 37015921; PMCID: PMC10073094.


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