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  • LncRNA MGCG-膠質母細胞瘤的治療靶點

    欄目:最新研究動態 發布時間:2024-01-17
    本研究表明MGCG具有促進GBM發展的潛力,可能成為腫瘤分子診斷和治療的候選藥物......

           膠質母細胞瘤(GBM)是成人最常見的原發性惡性腦癌。lncRNAs在癌癥的發生發展中發揮著重要作用。為了闡明lncRNA在膠質母細胞瘤發展中的作用,我們使用了來自GBM患者的三個新分離的腫瘤組織樣本和來自創傷患者的三個正常腦組織樣本,進行了高通量RNA測序以獲得轉錄本。隨后,一種lncRNA MGCG在GBM中未被報道,被發現與患者預后相關。生物信息學分析結果顯示,MGCG與自噬相關,且與自噬相關基因ATG2A的表達呈正相關。質譜數據表明,hnRNPK蛋白是與MGCG相互作用的直接靶點,MGCG/hnRNPK通過增強ATG2A的翻譯和自噬促進GBM的發展。綜上所述,本研究表明MGCG具有促進GBM發展的潛力,可能成為腫瘤分子診斷和治療的候選藥物。本研究于2023年7月發表于“Cell Death and Disease”(IF=9.0)上。
    技術路線


    結果
    1)MGCG在GBM中高水平表達,與預后不良相關
           為了獲得lncRNAs和mRNA的表達譜,我們獲得3個GBM組織樣本和3個正常腦組織樣本,并進行高通量RNA測序(GSE153692)。RNA測序結果顯示,MGCG在GBM組織中的表達明顯高于正常組織(圖1A)。接下來,我們通過RT-qPCR驗證了MGCG在22個正常腦組織樣本(顱腦外傷患者)和47個GBM組織樣本中的表達,結果表明MGCG在GBM組織中的表達水平明顯高于正常組織(圖1B)。RT-qPCR結果顯示,MGCG在GBM細胞中的表達明顯高于HEB細胞(圖1C)。為了確定MGCG的細胞定位,我們對細胞核和細胞質RNA進行了RT-qPCR,數據顯示MGCG優先位于細胞核中(圖1D)。接下來,我們在LN229細胞中進行RNA FISH驗證這些結果(圖1 E)。RNA FISH結果顯示,MGCG在GBM中與正常組織相比上調(圖1F)。我們評估了MGCG表達與GBM患者預后之間的相關性。Kaplan-Meier分析和MGCG表達與臨床患者生存期的相關性分析結果顯示,MGCG表達較高的患者總體生存期較差(圖1G)。綜上所述,這些數據提示MGCG上調在GBM組織中普遍存在,且與預后不良相關。


    2)MGCG促進GBM的腫瘤進展和自噬
           為了探索MGCG的生物學功能,我們設計了三種獨立的siRNA來對抗MGCG,我們選擇了兩種siRNA來有效地抑制MGCG在LN229和U251細胞中的表達(圖2A, 2B)。我們還構建了一個過表達質粒,并成功地在LN229和U251細胞中過表達MGCG(圖2C, 2D)。集落形成實驗的結果表明,MGCG的缺失顯著抑制了細胞增殖。而MGCG的過表達促進了細胞活力(圖2E)。我們在Transwell實驗中證實,MGCG的下調顯著降低了細胞的遷移能力;然而,MGCG過表達增加了細胞的遷移能力(圖2F)。此外,流式細胞術和TUNEL實驗結果表明,MGCG的敲低誘導細胞凋亡,上調MGCG的表達抑制細胞凋亡(圖2G,2 H)?;赗NA測序數據研究MGCG在GBM中的作用,我們進行了生物信息學分析,并證明MGCG與自噬有關(圖2I)。western blotting結果顯示,MGCG過表達增加了LC3-II結合和p62降解,表明MGCG誘導了GBM細胞的自噬(圖2J)。結果表明,MGCG的表達與GBM的惡性表型相關,MGCG促進了GBM的自噬。


    3)MGCG通過調節ATG2A的表達促進GBM的進展
           許多研究表明,自噬促進GBM的發展。一致地,我們證明了自噬在過表達MGCG的GBM細胞中升高。ATG2A是一種與自噬相關的基因,我們已經知道敲低ATG2A會抑制自噬,但對ATG2A的研究很少。RT-qPCR數據證明,在GBM組織臨床樣本中,MGCG的表達與ATG2A呈顯著正相關(圖3A)。接下來,我們敲低了ATG2A,發現LN229細胞中LC3-II與LC3-I的蛋白水平比值降低,p62蛋白水平升高(圖3B)。為了研究MGCG是否調控ATG2A的表達,我們敲低了MGCG,分別根據RT-qPCR和western blotting的數據證實了ATG2A mRNA和蛋白的表達水平降低(圖3C, 3D)。我們通過RT-qPCR驗證了ATG2A在27個正常組織樣本和42個GBM組織樣本中的表達,證實了ATG2A在GBM組織中的表達水平顯著升高(圖3E)。此外,根據TCGA數據庫,ATG2A的低表達與患者總生存率的提高相關(圖3F)。此外,我們還研究了ATG2A對GBM進展的影響。首先,我們通過RT-qPCR和western blot檢測ATG2A在GBM細胞中的敲除效率(圖3G-3J)。ATG2A的下調抑制了GBM細胞的增殖(圖3K)和遷移(圖3L),促進了GBM細胞的凋亡(圖3M)。然后,我們將含有ATG2A siRNA的質粒和過表達MGCG的質粒共轉染到LN229和U251細胞中,我們證明了ATG2A的下調抑制了自噬,過表達MGCG恢復了自噬的抑制(圖3N)。敲低ATG2A可消除MGCG過表達對細胞增殖、遷移和凋亡的影響(圖3O-Q)。這些結果表明MGCG調節ATG2A的表達,促進細胞自噬。


    4)MGCG直接與hnRNPK相互作用,促進ATG2A的翻譯
           為了進一步探索MGCG在GBM中的作用機制,我們使用特異性生物素標記的MGCG探針進行了RNA下拉實驗。與陰性探針相比,銀染色結果顯示了幾個額外的蛋白質條帶,質譜分析鑒定出hnRNPK是與MGCG結合的主要蛋白質(圖4A,B)。RIP實驗的數據證實了MGCG和hnRNPK之間的直接相互作用(圖4C)。FISH和IF數據顯示,MGCG和hnRNPK在GBM細胞中共定位(圖4D)。western blot分析結果顯示,MGCG的敲低或MGCG的過表達分別抑制或升高了GBM細胞中hnRNPK的蛋白水平(圖4E)。為了確定hnRNPK是否可以調節ATG2A的表達,我們進行了RT-qPCR,并證明了hnRNPK敲低后ATG2A的RNA水平沒有變化(圖4F)。western blotting結果顯示,當hnRNPK被敲低時,ATG2A蛋白水平下調(圖4G)。為了確定hnRNPK是否調控ATG2A在GBM中的翻譯,我們使用RIP證明hnRNPK與ATG2A mRNA結合(圖4H),RNA下拉結果表明hnRNPK與ATG2A mRNA之間存在相互作用(圖4I)。接下來,我們進行了IP分析,證實了hnRNPK在GBM中與EIF4B結合(圖4J)。我們通過far western blot進一步證實了hnRNPK與EIF4B之間的相互作用(圖4K)。western blot結果顯示,敲低EIF4B抑制ATG2A蛋白水平;然而,在LN229細胞中,下調EIF4B后,ATG2A的RNA水平沒有變化(圖4L, 4M)。敲低hnRNPK降低ATG2A蛋白水平;然而,過表達MGCG消除了hnRNPK敲低的作用(圖4N)。這些結果表明,MGCG通過結合hnRNPK促進了ATG2A的翻譯。


    5)DNA低甲基化上調GBM中MGCG的表達
           我們探討了MGCG在GBM中高表達的機制。首先,我們利用UCSC基因組生物信息學網站確定了MGCG中的CpG島(圖5A),數據表明MGCG表達與DNA甲基化之間存在潛在關系。利用甲基化分析軟件,我們在MGCG啟動子區域檢測到一個CpG島。設計了兩組特異性引物來檢測該CpG島DNA甲基化水平的變化(圖5B)。接下來,使用甲基化特異性PCR (MSP),我們證明GBM細胞的甲基化水平低于HEB細胞(圖5C)。為了進一步探討MGCG中甲基化變化的機制,我們檢測了DNA甲基轉移酶(DNMT)在GBM細胞中的表達水平。RT-qPCR數據顯示,與HEB細胞相比,DNMT3B在GBM細胞中的表達下調(圖5D)。我們用DNMT3B特異性抑制劑DS-437處理LN229和U251細胞,發現MGCG在LN229和U251細胞中的表達增加,表明DNA去甲基化增加了MGCG的表達(圖5E)。DNMT3B過表達導致MGCG甲基化水平增加(圖5F)。過表達DNMT3B可顯著抑制MGCG在GBM細胞中的表達(圖5G)。這些發現表明DNMT3B促進了MGCG在GBM細胞中的表達。


    6)MGCG/hnRNPK/ATG2A軸促進GBM的進展
           為了研究MGCG在體內的作用,將2.5×105熒光素標記的MGCG敲低或sh-NC轉導的GBM細胞注射到裸鼠體內,體內腫瘤異種移植實驗方案如圖6A所示。通過體內生物發光成像追蹤腫瘤進展,攜帶MGCG敲低的GBM細胞的異種移植物在腫瘤生長方面表現出明顯的退行(圖6B,6C)。MGCG敲低導致小鼠存活率提高(圖6D)。RNA FISH數據顯示,MGCG敲低小鼠GBM細胞中MGCG表達降低(圖6E)。免疫組化(IHC)顯示,MGCG敲低后hnRNPK和ATG2A表達降低,cleaved caspase-3水平升高(圖6F),這些結果表明MGCG/hnRNPK/ATG2A促進了GBM的進展。


    結論
           我們發現了一種新的lncRNA-MGCG,作為一種致癌基因,促進GBM的增殖和遷移。接下來,我們驗證了MGCG與自噬有關。我們證明MGCG直接與hnRNPK結合,并且MGCG/ hnRNPK促進ATG2A的翻譯。因此,本研究揭示了lncRNA調控GBM生長的機制,并確定了GBM治療的潛在治療藥物靶點。

    實驗方法
    qRT-PCR,FISH,克隆形成實驗,transwell,TUNEL實驗,流式,WB,Far WB,IF,RNA pull down,RIP,IHC。
    參考文獻
    Chu F, Wu P, Mu M, Hu S, Niu C. MGCG regulates glioblastoma tumorigenicity via hnRNPK/ATG2A and promotes autophagy. Cell Death Dis. 2023 Jul 17;14(7):443. doi: 10.1038/s41419-023-05959-x. 


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