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  • 抑制“行走的殺手”骨關節炎的“利器”之抑制PIM-1激酶

    欄目:最新研究動態 發布時間:2024-01-12
    骨關節炎(OA)是一種炎癥性關節炎,巨噬細胞驅動的滑膜炎被認為與軟骨破壞密切相關,可發生在任何階段......

           骨關節炎(OA)是一種炎癥性關節炎,巨噬細胞驅動的滑膜炎被認為與軟骨破壞密切相關,可發生在任何階段。然而,目前還沒有有效的治療骨性關節炎進展的靶點?;ぞ奘杉毎械腘OD-、LRR-和pyrin結構域蛋白3(NLRP3)炎癥小體參與病理性炎癥過程,所以針對它的治療策略被認為是治療OA的有效途徑。PIM-1激酶作為多種細胞因子信號通路的下游效應者,在炎癥性疾病中發揮促炎作用。
           在這項研究中,研究者評估了PIM-1的表達和滑膜巨噬細胞在人骨性關節炎滑膜中的滲透。以小鼠和人巨噬細胞為模型,研究了PIM-1對脂多糖(LPS)和尼日利亞菌素、三磷酸腺苷、尿酸鈉(MSU)、鋁鹽等激動劑的作用及其機制。采用改良的巨噬細胞條件培養液(CM)共培養體系評價其對軟骨細胞的保護作用。體內療效通過內側半月板(DMM)誘導的小鼠骨性關節炎得到證實。
           PIM-1在人骨性關節炎滑膜中的表達增加,并伴有滑膜巨噬細胞的浸潤。在體外實驗中,特異性抑制劑SMI-4a對PIM-1的抑制作用迅速抑制了小鼠和人巨噬細胞中NLRP3炎癥小體的激活以及gasdermin-D(GSDME)介導的細胞焦亡。此外,PIM-1的抑制在組裝階段特異性阻斷了含有CARD(ASC)寡聚化的凋亡相關斑點樣蛋白。機制上,PIM-1的抑制可減輕線粒體活性氧(ROS)/氯離子胞內通道蛋白(CLICs)依賴的Cl -外泄信號通路,最終導致ASC寡聚化和NLRP3炎性體活化受阻。此外,PIM-1的抑制在改良的共培養系統中顯示出軟骨保護作用。最后,SMI-4a顯著抑制滑膜中PIM-1的表達,并降低DMM誘導的OA模型中的滑膜炎評分和國際骨關節炎研究協會(OARSI)評分。本文于2023年7月發表在《Journal of Translational Medicine》期刊上,IF=7.4。
    技術路線


    主要實驗結果
    1、人骨關節炎滑膜巨噬細胞PIM-1表達上調
           探討PIM-1在巨噬細胞和骨性關節炎進展中的作用。研究者研究了巨噬細胞標志物(F4/80)在人滑膜中的表達。與之前的研究一樣,與正?;は啾?,骨性關節炎患者滑膜中F4/80陽性細胞的數量增加(圖1a,b)。此外,在骨性關節炎患者的滑膜中,PIM-1陽性細胞的百分比也升高(圖1a,c)。有趣的是,PIM-1主要定位于巨噬細胞,PIM-1和F4/80共存。綜上所述,這些結果表明巨噬細胞在OA滑膜中聚集,并增加PIM-1的表達。


    圖1 巨噬細胞和PIM-1在OA滑膜中表達上調


    2、PIM?1的抑制抑制了NLRP3炎性體的激活
           為了確定Smi-4a是否特異性地抑制巨噬細胞中的PIM-1,研究者用Smi-4a對脂多糖誘導的BMDM(骨髓源性巨噬細胞)進行了2 h的蛋白質印跡分析。結果表明,SMI-4在LPS刺激(3.3 μm, 10 μm, 30 μm)后可下調jak2、stat的磷酸化水平,并呈劑量依賴性(圖2a)。這意味著PIM-1活性被SMI-4a抑制。此外,研究者在尼日利亞菌素或ATP刺激用Smi-4a培養脂多糖誘導的BMDM。結果表明,SMI-4a以劑量依賴性(3.3 μm, 10 μm, 30 μm抑制pro-IL-1β(P31)和pro-caspase-1(P45)裂解為IL-1β(P17)和caspase-1(P20)(圖2b、c),但不影響TNF-a的分泌。生長因子IL-3可通過JAK/ STAT信號通路上調PIM-1的活性。值得注意的是,研究者的研究結果表明,添加IL-3(25和50ng/ml)可以恢復SMI-4a(10 μm)誘導的jak2、stat的低磷酸化水平(圖2d)。這意味著補充IL-3(25和50ng/ml)可以恢復PIM-1的活性。此外,PIM-1的激活能夠“挽救”SMI-4a(30 μm)誘導的IL-1β分泌下調(圖2e和f),而不改變TNF-a分泌。這些發現表明,PIM-1可以參與NLRP3炎性小體激活的組裝階段,而不影響啟動階段。
           為了觀察PIM-1對巨噬細胞中NLRP3炎癥小體的啟動階段和組裝階段的作用,在LPS刺激前和刺激后應用SMI-4a。結果表明,在LPS刺激前預處理SMI-4a抑制了TNF-α的產生、pro-IL-1β和NLRP3蛋白的表達,而在LPS刺激后用SMI-4a處理時,這些沒有明顯變化(圖2g–i)。這些發現表明,PIM-1的抑制可抑制NF-κB信號通路,并可在啟動期和裝配期抑制NLRP3炎癥小體的激活。研究者繼續探索當巨噬細胞在LPS刺激后用SMI-4a處理時,PIM-1在裝配階段的作用。有趣的是,被SMI-4a抑制的PIM-1顯示出對NLRP3炎癥小體激活的快速抑制作用(圖2j–l)。為了進一步消除SMI-4a脫靶的可能性,這項研究還發現,另一種PIM-1抑制劑AZD1208可以快速抑制NLRP3炎癥小體激活的組裝階段,而不影響啟動階段。


    圖2 . PIM-1的阻斷抑制了巨噬細胞NLRP3炎性體活化


    3、阻斷PIM?1可廣泛抑制NLRP3、AIM2、NLRC4炎性體和焦亡,并特異性減輕ASC低聚物的形成
           為了進一步研究PIM-1是否在NLRP3炎性小體激活中起共同作用,研究者在不同的巨噬細胞中使用不同的激動劑研究了PIM-1對NLRP3炎性小體激活的作用。研究者發現SMI-4a劑量依賴性地抑制小鼠和人巨噬細胞NLRP3炎性體的激活,如雄性C57BL/6小鼠的PMs(圖3a, b),THP-1細胞(圖3c, d),健康人的外周血單核細胞(PBMC)。除尼日利亞菌素外,SMI-4a還能抑制MSU和Alum誘導的caspase-1裂解和IL-1β分泌(圖3e, f)。
           為了探究PIM-1是否在NLRP3炎性小體激活中起特定作用,研究者研究了PIM-1在NLRC4和AIM2炎性小體激活中的作用。結果顯示SMI-4a對AIM2炎性小體和NLRC4炎性小體具有抑制作用,可由poly(dA:dT)轉染或沙門氏菌感染觸發(圖3g, h),導致IL-1β產生減少。
           LDH釋放和GSDMD裂解是炎性小體誘導的焦亡的兩個關鍵特征。然后,研究者發現SMI-4a對PIM-1的抑制可以抑制LDH的釋放,阻斷GSDMD的裂解(圖3i, j)。接下來,研究者研究了PIM-1如何影響NLRP3炎性體形成的組裝階段。NLRP3和ASC之間的相互作用對于NLRP3炎性體的組裝至關重要。共免疫沉淀(CO-IP)結果表明SMI-4a不影響NLRP3和ASC的相互作用。在NLRP3和ASC裝配后,隨后的ASC募集形成ASC寡聚體和ASC斑點。結果首先表明,PIM-1抑制可以特異性減弱尼日利亞菌素誘導的DSS交聯的ASC寡聚體和ASC-斑點(圖3k - m)。


    圖3  PIM-1的抑制廣泛抑制了NLRP3、AIM2、NLRC4炎性體和焦亡,并特異性減輕了ASC低聚物形成


    4、PIM-1的抑制阻斷了Cl-外排以抑制ASC寡聚化
           Cl-外排在ASC寡聚化中起著至關重要的作用,并且是NLRP3炎癥小體激活的重要上游事件。為了了解PIM-1對Cl-流出的影響,研究者進行了離子置換實驗來驅動K+或Cl-的流出。與以前的研究一致,單獨的無氯條件不會引起IL-1β的釋放,但它可以進一步增強無鉀條件引起的IL-1β的釋放。此外,在用SMI-4a處理的這些上清液中沒有觀察到IL-1β(圖4a)。此外,在無K+和Cl-的條件下,SMI-4a可以劑量依賴性地抑制IL-1β的釋放(圖4b,c)。與先前的研究一致,研究者發現無K+和無Cl-的條件可以激活ASC寡聚化。SMI-4a可以減輕由尼日利亞菌素或無K+和Cl-條件引起的ASC寡聚化(圖4d)。以上結果提示,PIM1抑制NLRP3炎性小體激活可能與Cl?外流有關。
           如圖4e,f所示,nigericin或無K+和Cl-條件顯著增加了細胞內熒光強度,表明細胞內Cl-水平降低,Cl-流出增強。但是,這些進程被SMI-4a阻止了。氯離子細胞內通道蛋白(CLICs)家族由CLIC1、CLIC4和CLIC5組成,存在于胞漿和質膜中。CLICs可以移位到質膜上,形成陰離子通道,介導細胞內的Cl-外流。研究者進一步探索SMI-4a誘導的Cl-外排變化是否是通過阻斷CLICs轉運介導的。蛋白質印跡分析表明,SMI-4a可以阻斷由尼日利亞菌素和無K+和Cl-條件誘導的CLICs易位(圖4g,h)。綜上所述,研究者首次表明PIM-1在CLICs轉運和Cl-外流中發揮關鍵作用,以實現ASC寡聚化和NLRP3炎癥小體激活。


    圖4  PIM-1的抑制可阻斷Cl?外排,從而抑制巨噬細胞中ASC的低聚化


    5、PIM-1的抑制通過線粒體ROS阻斷Cl-外排
           線粒體ROS在Cl-流出的上游起作用,加速NLRP3炎癥體的激活,并在AIM2和NLRC4炎癥體的激活中起關鍵作用。為了研究PIM-1抑制是否通過調節線粒體ROS阻斷Cl-外排和NLRP3炎癥小體激活,研究者首先使用MitoSOX紅色探針檢測巨噬細胞中線粒體ROS的水平。結果顯示,伴隨線粒體ROS和SMI-4a而產生的NLRP3炎癥激活可以抑制線粒體的ROS水平(圖5a,b)。此外,在SMI-4a和尼日利亞菌素孵育之前,用魚藤酮(一種線粒體電子傳遞鏈復合物I抑制劑)處理LPS誘導的BMDMs時,線粒體ROS的產生顯著增加。這一發現表明魚藤酮阻斷了SMI-4a對線粒體ROS產生的抑制功能(圖5c,d)。此外,魚藤酮預處理后,Cl-外排和NLRP3炎癥小體的激活增強(圖5e - h)??傊?,這些結果首次表明PIM-1的抑制抑制了線粒體ROS的產生并阻斷了Cl-外排,導致了對NLRP3炎癥小體的抑制作用。


    圖5 PIM-1的抑制抑制了線粒體ROS的產生,從而阻斷了巨噬細胞中Cl-的流出


    6、在共培養體系中,PIM-1的抑制抑制了軟骨細胞凋亡并改善軟骨細胞增殖和ECM代謝
           研究者進一步利用共培養系統來研究巨噬細胞和軟骨細胞的相互作用。首先,研究者應該檢測SMI-4a對軟骨細胞的細胞毒性作用。結果顯示濃度< 50 μM的SMI-4a 處理軟骨細胞24或48小時沒有顯著的細胞毒性作用(圖6b)。隨后,研究者用參與NLPR3炎癥體激活的各種單一成分刺激巨噬細胞,并用CM培養軟骨細胞。有趣的是,與對照組相比,Nigericin組軟骨細胞的活性降低,而其他組無明顯變化。這意味著從用尼日利亞菌素處理的巨噬細胞收集的CM對軟骨細胞具有明顯的毒性作用(圖6c)。最終,研究者放棄了尼日利亞菌素,選擇了無K+和Cl-的條件來激活NLRP3炎癥小體。因此,建立了改良的巨噬細胞-軟骨細胞共培養系統(圖6a)。
           在該共培養系統中,與無LPS+KCl組相比,在SMI4a處理下軟骨細胞的存活力增加(圖6d)。從TUNEL染色中觀察到一致的結果(圖6g,h)。此外,與無LPS+KCl組相比,SMI-4a處理后,裂解的caspase 3和Bax的表達降低,Bcl-2的表達升高(圖6e)。這些結果表明,PIM-1的抑制可以減輕軟骨細胞凋亡。此外,與無LPS+KCl組相比,在SMI-4a處理下,膠原II和聚集蛋白聚糖的表達水平增加,MMP13和ADAMTS5的表達水平降低(圖6f)。這些結果表明,抑制PIM-1可以恢復軟骨細胞的細胞外基質代謝。EDU染色顯示,與無LPS+ KCl組相比,用SMI-4a處理的軟骨細胞的增殖水平增加(圖6i和j)?;谠摻Y果,如Toloniumchloride和S&F染色的染色強度和細胞面積分數的增加所示(圖6k – n),用SMI-4a處理的軟骨細胞的數量增加。這些結果首次證明PIM-1的抑制對軟骨細胞增殖有有益的影響。


    圖6 在共培養體系中PIM-1的抑制防止了軟骨細胞損傷


    7、PIM-1的抑制可以改善DMM模型小鼠骨關節炎的進展
           該研究進一步探索了PIM-1抑制對體內OA的潛在治療作用。H&E染色顯示,smim4a治療DMM小鼠改善了滑膜的肥大和增生,并降低了滑膜襯里細胞層的厚度(圖7b)。結果表明SMI-4a可以降低滑膜炎評分,該評分在DMM組中升高(圖7c)。此外,與人類OA滑膜一致,與巨噬細胞共定位的PIM-1(F4/80)在DMM小鼠中顯著上調(圖7d–f)。然而,用SMI-4a處理對PIM-1的抑制表明滑膜中的這些陽性細胞顯著下調。此外,S&F染色顯示,與DMM組相比,SMI-4a的治療改善了粗糙和糜爛的關節表面軟骨、軟骨細胞減少和異常狹窄的關節間隙。結果表明SMI-4a可以降低在DMM組中升高的OARSI評分(圖7h)。這些蛋白質的免疫組織化學在OA的發展中起著特征性的病理學指示作用,如膠原II、聚集蛋白聚糖、MMP13、ADAMTS5和cleaved-caspase3。與DMM組相比,用SMI-4a處理改善了II型膠原和聚集蛋白聚糖的下調,并抑制了MMP13、ADAMTS5和cleaved-caspase3的上升(圖7i)。出于SMI-4a的安全性考慮,測試了肝酶丙氨酸轉氨酶(ALT)和天冬氨酸轉氨酶(AST)的血清水平的肝毒性(圖7j),評估了血尿素氮(BUN)和肌酐(Cre)的腎毒性(圖7k),評估了體重的全身毒性(圖7l)。與對照組和DMM組相比,這些參數在SMI-4a處理后均無明顯變化。此外,從肝、脾和腎的H&E染色中沒有觀察到明顯的變化(圖7m)。研究者的體內研究結果首次表明PIM-1抑制可以在OA小鼠中發揮保護作用。


    圖7  PIM-1抑制改善了小鼠DMM模型中OA的進展


           總之,我們的研究強調PIM-1是治療OA的有效靶點。抑制PIM-1可抑制NLRP3炎癥體和GSDMED介導的細胞焦亡,其機制可能是通過阻斷組裝階段線粒體ROS/Cl?外流來實現。我們的研究表明,PIM-1特異性抑制劑能有效地治療小鼠骨性關節炎。因此,PIM-1代表了一類新的有希望的治療OA的靶點,靶向于巨噬細胞中的這些機制,并拓寬了治療OA策略的道路。

    實驗方法
    酶聯免疫吸附、乳酸脫氫酶釋放試驗、WB、細胞內氯離子水平的評估、H&E染色、S&F染色
    參考文獻
    Zhang, Z. et al. Targeting macrophagic PIM-1 alleviates osteoarthritis by inhibiting NLRP3 inflammasome activation via suppressing mitochondrial ROS/Cl? efflux signaling pathway. Journal of Translational Medicine 2023 Jul, 21:452 doi:10.1186/s12967-023-04313-1


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