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  • LINC02159通過ALYREF/YAP1信號通路促進非小細胞肺癌進展

    欄目:最新研究動態 發布時間:2023-12-20
    經研究發現,LINC02159通過調節信號通路,在NSCLC進展中發揮致瘤作用,具有作為NSCLC診斷標志物和治療靶點的潛力......

           肺癌是全球癌癥相關死亡的主要原因。lncRNAs已成為癌癥發生和進展的關鍵調控因子,并成為癌癥診斷和預后的有前途的生物標志物。在這項研究中,我們發現了一個新的lncRNA (LINC02159),在非小細胞肺癌(NSCLC)患者的腫瘤組織和血清中表達上調。我們證實,在體外實驗中,LINC02159的下調抑制了NSCLC細胞的增殖、遷移和侵襲,但誘導了細胞凋亡和細胞周期阻滯,在體內則延緩了腫瘤的生長,而過表達LINC02159則起到相反的作用。我們通過轉錄組學分析發現LINC02159與腫瘤生長和轉移相關通路高度相關,YAP1是LINC02159的潛在靶基因。機制上,LINC02159結合ALYREF,通過m5C修飾增強YAP1 mRNA的穩定性,導致YAP1過表達,激活NSCLC細胞中Hippo和β-catenin信號通路。拯救實驗顯示,LINC01259以YAP1和ALYREF依賴的方式促進NSCLC進展。綜上所述,LINC02159通過調節ALYREF/YAP1信號通路,在NSCLC進展中發揮致瘤作用,具有作為NSCLC診斷標志物和治療靶點的潛力。本文于2023年8月發表于“Molecular Cancer”(IF=37.3)上。
    技術路線


    結果
    1)LINC02159在非小細胞肺癌中表達上調,與不良預后相關
           為了鑒定NSCLC中失調的lncRNA,我們對來自NSCLC患者的匹配腫瘤組織和鄰近非腫瘤組織進行了RNA測序。RNA測序結果顯示,與鄰近非腫瘤組織相比,腫瘤組織中有84個lncRNA上調,89個lncRNA下調(圖1A和1B)。圖1C列出了腫瘤組織中上調最多的10個lncRNA。其中,我們選擇LINC02159進行進一步研究,因為到目前為止還沒有在癌癥中進行研究。我們驗證了與HBE細胞相比,LINC02159在人NSCLC細胞系(A549、H1299和PC9)中的表達上調(圖1D)。然后,我們通過核/細胞質分離和FISH實驗檢測了LINC02159在NSCLC細胞中的分布,發現LINC02159主要定位于NSCLC細胞的細胞核中(圖1E和F)。接下來,我們檢測了LINC02159在NSCLC患者配對腫瘤組織和鄰近非腫瘤組織中的表達。qRT-PCR結果顯示,LINC02159在72%的腫瘤組織中的表達水平高于鄰近的非腫瘤組織(圖1G)。同時,我們觀察到,與肺炎患者和健康人相比,LINC02159在NSCLC患者血清中的表達明顯上調(圖1H)。NSCLC患者與健康個體的受試者工作特征曲線下面積(AUC)為0.879,敏感性為76.6%,特異性為91.49%,而區分NSCLC患者與肺炎患者的AUC為0.907,敏感性為78.72%,特異性為90.91%(圖1I)。我們進一步利用TCGA數據分析了LINC02159的表達,結果也顯示了LINC02159在NSCLC患者腫瘤組織中的表達上調(圖1I)。綜上所述,這些數據表明LINC02159可作為非小細胞肺癌診斷和預后的生物標志物。


    2)LINC02159在NSCLC進展中發揮致癌作用
           為揭示LINC02159在非小細胞肺癌中的生物學功能,我們利用特異性siRNA對LINC02159進行了功能缺失研究,并通過qRT-PCR驗證了LINC02159在NSCLC細胞中的敲低效率(圖2A)。CCK-8和細胞集落形成實驗的結果顯示,LINC02159敲低顯著抑制了NSCLC細胞的增殖(圖2B和C)。流式細胞術分析的結果進一步證明,LINC02159敲低在NSCLC細胞中誘導凋亡細胞數量增加和細胞周期阻滯(圖2D和E)。此外,western blot結果顯示,LINC02159敲低可上調NSCLC細胞中Bax蛋白的表達,下調Bcl-2的表達(圖2F)。LINC02159的敲低還抑制了NSCLC細胞的遷移和侵襲能力(圖2G和H)。LINC02159的敲低增加了E-cadherin的表達,降低了N-cadherin和Vimentin的表達,以及Slug和Snail等上皮-間質轉化(EMT)因子的表達(圖2I)。為了進一步驗證LINC02159在NSCLC進展中的作用,我們使用對照和LINC02159敲低的NSCLC細胞建立了小鼠皮下移植瘤模型。我們發現,與對照組相比,LINC02159敲低組小鼠腫瘤的體積和重量更小(圖2J)。通過Ki-67免疫組化染色和TUNEL染色證實,LINC02159敲低組小鼠腫瘤組織中增殖腫瘤細胞數量減少,凋亡細胞數量增加(圖2K)。綜上所述,這些結果表明LINC02159在NSCLC進展中發揮致癌作用。


    3)LINC02159在NSCLC中與ALYREF蛋白相互作用,并與ALYREF正相關
           為了了解LINC02159在非小細胞肺癌中的致癌作用機制,我們進行了TRAP檢測,以鑒定LINC02159相互作用蛋白,因為它已被證明主要定位于細胞核中(圖3A-D)。質譜分析結果顯示,與MS2組相比,LINC01259-MS2組中有幾種蛋白質富集。我們選擇ALYREF作為接下來的研究,因為它有最高的折疊變化。我們通過另一個獨立的TRAP實驗驗證了LINC01259與ALYREF的結合(圖3E)。RIP實驗結果證實,在NSCLC細胞中,LINC02159富集于ALYREF免疫沉淀復合物中(圖3F)。免疫熒光染色結果顯示,LINC02159與ALYREF在NSCLC細胞核中共定位(圖3G)。LINC02159的敲低抑制和過表達增強了ALYREF蛋白的表達,但對其mRNA的影響很小(圖3H和3I)。LINC02159敲低導致ALYREF蛋白從細胞核重新定位到細胞質(圖3J和3K)。我們隨后分析了ALYREF蛋白在NSCLC患者腫瘤和非腫瘤組織中的表達,發現ALYREF蛋白在93%的腫瘤組織中高表達,同時LINC02159水平升高(圖3L)??傊?,這些發現表明LINC02159可能通過與ALYREF相互作用在NSCLC中發揮促瘤作用。


    4)ALYREF在NSCLC中上調并促進NSCLC進展
           ALYREF作為m5C修飾的讀取器,調控mRNA加工和核輸出。我們首先研究了ALYREF在NSCLC中的表達模式和生物學功能。TCGA數據分析結果顯示,與非腫瘤組織相比,ALYREF在NSCLC患者的腫瘤組織中顯著上調,AUC為0.882(圖4A和B)。生存時間分析結果顯示,高水平的ALYREF預示著NSCLC患者的整體預后更差(圖4C)。功能缺失研究進一步表明,ALYREF敲低可降低NSCLC細胞的增殖、遷移和侵襲,并誘導細胞凋亡和細胞周期阻滯(圖4D-K)。ALYREF敲低可上調NSCLC細胞中Bax蛋白的表達,下調Bcl-2的表達(圖4L)。ALYREF敲低增加了E-cadherin的表達,降低了N-cadherin和vimentin的表達,以及Slug和Snail等EMT轉錄因子的表達(圖4M)。綜上所述,ALYREF在NSCLC中上調,并作為致癌基因促進NSCLC進展。


    5)LINC02159通過ALYREF介導的m5C修飾調控NSCLC中YAP1信號
           接下來,我們想知道LINC02159在NSCLC中調控的下游基因和信號通路。RNA測序分析LINC02159敲低的NSCLC細胞中改變的基因。結果顯示,與對照細胞相比,LINC02159敲低的NSCLC細胞中有409個基因上調,583個基因下調(圖5A和B)。此外,KEGG富集分析結果顯示,LINC02159敲低影響了許多與癌癥相關的通路,如Hippo、JAK-STAT3和MAPK信號通路(圖5C)。我們選擇了9個在LINC02159敲低的NSCLC細胞中下調的基因,包括HMGA2、LIN28B和YAP1等。因為這些基因已被證明對癌癥的發生和發展至關重要(圖5D)。我們關注的是YAP1,因為LINC02159敲低降低了其在NSCLC細胞中的基因表達(圖5E),我們證實,ALYREF敲低降低了NSCLC細胞中YAP1基因的表達(圖5F)。Western blot結果顯示,LINC02159和ALYREF敲低降低,而LINC02159過表達增加了YAP1蛋白的表達(圖5G-I)。既往研究表明,YAP與TEAD轉錄因子相互作用,激活Hippo通路關鍵靶基因的表達,包括CTGF、CYR61、AXL、ANKRD1等。因此,我們利用qRT-PCR檢測了LINC02159和ALYREF敲低對這些靶基因的影響。結果顯示,與對照組相比,LINC02159-、ALYREF-和YAP1敲低組中Hippo通路靶基因的表達顯著降低,表明LINC02159通過YAP1調控TEAD活性(圖5J、K)。RIP結果顯示,在NSCLC細胞中,YAP1 mRNA富集于ALYREF-免疫沉淀復合物中(圖5L)。LINC02159敲低降低了ALYREF與YAP1 mRNA的結合(圖5M)。此外,LINC02159敲低顯著降低了YAP1 3 ' -UTR的m5C水平(圖5N)。隨后,我們通過Act D實驗發現,LINC02159/ALYREF敲低削弱了YAP1 mRNA的穩定性(圖5O)。這些結果表明,LINC02159通過ALYREF介導的m5C修飾調控YAP1 mRNA的表達和穩定性。


    6)LINC02159通過YAP1/β-catenin軸促進NSCLC進展
           既往研究表明,YAP1不僅作為轉錄共激活因子參與Hippo通路,而且作為Wnt/β-catenin信號通路的關鍵調控因子。此外,YAP1還可以調解它們之間的相互串擾。以P < 0.05和fold change > 1.5為過濾條件,KEGG富集分析結果顯示,在LINC02159敲低組中,Wnt/β-catenin信號通路顯著富集(圖6A)。因此,我們研究LINC02159是否也會影響NSCLC中Wnt/β-catenin信號通路的激活狀態。Western blot結果顯示,與對照組相比,LINC02159和ALYREF敲低組β-catenin、c-Myc和cyclin-D1的表達顯著降低,而過表達LINC02159則相反(圖6B-D)。為了進一步分析ALYREF、YAP1和LINC02159的相互作用,我們在NSCLC細胞中敲低LINC02159并同時過表達ALYREF。數據顯示,ALYREF過表達可以逆轉LINC02159敲低導致的YAP1下調(圖6E)。然后,我們研究了YAP1的過表達是否可以逆轉LINC02159敲低在NSCLC中的作用(圖6F)。功能增益和功能損失實驗結果顯示,LINC02159的敲低明顯抑制YAP1的表達和NSCLC細胞的生長、遷移和侵襲,但這種抑制作用可以被YAP1的過表達逆轉(圖6G-H)。這些結果表明,LINC01259通過YAP1/β-catenin軸促進NSCLC的進展。


    結論
           
    我們首次發現,一種新的lncRNA LINC01259通過與m5C修飾物ALYREF相互作用,提高YAP1 m5C水平和mRNA的穩定性和表達,從而促進NSCLC的進展。我們的研究為非小細胞肺癌提供了潛在的的診斷和預后生物標志物和治療靶點。

    實驗方法
    FISH,TRAP實驗,LC-MS/MS,RNA測序,RIP,體內動物實驗,qRT PCR,western blotting,CCK-8,克隆形成實驗,transwell,細胞周期和凋亡實驗,免疫熒光,RNA穩定實驗,生物信息學分析。
    參考文獻
    Yang Q, Wang M, Xu J, Yu D, Li Y, Chen Y, Zhang X, Zhang J, Gu J, Zhang X. LINC02159 promotes non-small cell lung cancer progression via ALYREF/YAP1 signaling. Mol Cancer. 2023 Aug 4;22(1):122. doi: 10.1186/s12943-023-01814-x. 


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