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  • 心肌梗死后,乳酸誘導Snail1乳酸化促進內皮-間充質轉化

    欄目:最新研究動態 發布時間:2023-12-01
    高乳酸水平與心臟病患者的預后和死亡率呈正相關,本研究中,作者報告了乳酸的新功能......



           高乳酸水平與心臟病患者的預后和死亡率呈正相關。內皮-間質轉化(EndoMT)在心臟纖維化中起著重要作用。本研究中,作者報告了乳酸的新功能,即在心肌梗死(MI)后,通過促進EndoMT增加心臟纖維化并加劇心功能不全。機制上,乳酸能上調缺氧/ MI后Snail1的核轉位和乳酸化。抑制Snail1可改善MI后乳酸誘導的心臟功能障礙,抑制乳酸刺激的EndoMT、Snail1的乳酸化和TGF-β/Smad2信號的激活。該研究于2023年2月發表在《Science Advances》,IF:13.6。
    技術路線







    主要研究結果
    1. 減少乳酸改善MI后的心功能和心臟纖維化
           腹腔注射糖酵解抑制劑2-脫氧-D-葡萄糖(2-DG)降低乳酸水平。2-DG 抑制MI引起的血清和心臟乳酸水平(圖1A、B)。值得注意的是,2-DG MI 小鼠的射血分數(EF%)和縮短分數(FS%)水平高于對照組MI小鼠(圖1C、D)。2-DG MI小鼠的左心室舒張末期容積(LVEDV)和左心室收縮末期容積(LVESV)值低于對照MI小鼠(圖E、F)這表明抑制乳酸生成改善MI后的心臟功能。此外,Masson三色染色顯示給予2-DG減少MI后的心臟纖維化(圖 1G)。這些數據表明乳酸的產生促進MI誘發的纖維化和心功能不全。
    2. 增加乳酸生成加劇MI后的心功能不全和心臟纖維化
           在誘導MI3小時后給小鼠補充乳酸,在MI1周和4周后用超聲心動圖評估心臟功能。圖1H顯示,腹腔注射乳酸(0.5 g/kg體重7天后,血清乳酸濃度恢復到正常水平。與假手術組相比,MI 顯著降EF% 和FS% 的值(圖1I 、J)與 MI 組相比,注射乳酸進一步降低EF%(7 天時降低14.0%,28 天時降低19.5%)和FS%(7 天時降低15.8%,28 天時降低21.6%)的值(圖1I、J)。同樣,乳酸處理也增加MI后LVEDV和LVESV的水平(圖1K、L)這些數據共同表明,乳酸水平升高加重MI后的心臟功能障礙。Masson三色染色表明乳酸給藥顯著誘導MI小鼠的心臟纖維化(圖1M)。


    圖1. 乳酸水平升高導致MI后心臟功能障礙惡化和心臟纖維化增加


    3. 抑制乳酸生成減輕MI后的心臟EndoMT
           與假手術組相比,MI誘導內皮標志物CD31和VE-cadherin(VE-鈣粘蛋白)表達(圖 2A)以及間充質標志物成纖維細胞特異性蛋白1(FSP1)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和Collagen1a1 表達(圖 2A)明顯增加。施用2-DG抑制乳酸產生提高 CD31和VE-cadherin的表達,同時消除MI誘導的 Collagen1a1、α-SMA和FSP1 的減少(圖2A)。同樣,用2-DG 處理上調內皮標志物Cdh5和Kdr的mRNA水平(圖2B)。相反,2-DG下調間質標志物Atca2、Col1a1、Fn1和S100a4的mRNA 表達(圖2B)??傊?,這些數據表明抑制乳酸減弱MI后的EndoMT進程。在添加或不添加2-DG的內皮細胞特異性綠色熒光蛋白(GFP)標記小鼠(TIE2GFP)中誘導MI,并用抗GF(綠色)和抗FSP1(紅色)抗體對心臟組織進行免疫熒光染色。如圖2C所示,與假手術組相比,MI 誘導GFP與FSP1的共定位。與此相反,2-DG抑制乳酸產生減輕MI誘導的GFP與FSP1的共定位,表明2-DG減少MI刺激的心肌EndoMT。此外,在MI或假手術后7天,從獲得的心臟中分離出內皮細胞,流式細胞術檢測分化成肌成纖維細胞的內皮細胞百分比。如圖2D所示,從假手術組小鼠體內分離的內皮細胞顯示,抗 CD31 和抗 CD114(內皮細胞標記物)抗體染色的GFP細胞最多,幾乎檢測不到Gp38(心臟成纖維細胞標記物)染色(圖2E)。然而,MI明顯增加GFP標記的內皮細胞中Gp38陽性染色細胞的數量和百分比。相反,用2-DG處理可抑制MI 誘導的Gp38陽性內皮細胞。


    圖2. 2-DG減弱MI誘導的EndoMT


    4. 高水平乳酸促進MI后心肌中的EndoMT
           WB顯示,對MI小鼠補充乳酸降低內皮細胞標記物(CD31和VE-cadherin)的水平,促進間充質標記物(FSP1、α-SMA和Collagen1a1)的表達(圖3A)qRT-PCR顯示,乳酸水平升高導致MI后Cdh5和Kdr mRNA水平降低(圖3B、C),并誘導Col1a1、Fn1和S100a4 mRNA水平升高(圖3D- F),表明乳酸誘導MI 后的EndoMT。用抗 GFP(綠色)和抗 FSP1(紅色)抗體進行免疫熒光染色顯示,與假手術組小鼠相比,MI 誘導GFP和FSP1的共定位(圖3G),這表明乳酸鹽處理后有更多的內皮細胞分化成成纖維細胞。同樣,流式細胞術顯示,MI 后乳酸鹽處理進一步上調GFP+gp38+ 細胞的數量(圖3H),表明乳酸鹽促進MI后的EndoMT。


    圖3. 補充乳酸鹽促進MI后的EndoMT


    5. 缺氧后,乳酸鹽刺激內皮細胞遷移、降低VE-cadherin的表達,并促EndoMT
           進行傷口愈合試驗和EdU摻入試驗,圖4A顯示,與常氧對照組相比,缺氧加速內皮細胞的遷移。此外,10 mM(而非5 mM)的乳酸顯著促進缺氧誘導的傷口愈合(圖4A),表明乳酸鹽能誘導缺氧挑戰下的內皮細胞遷移。同樣,EdU摻入試驗再次證明乳酸鹽能促進缺氧刺激的內皮細胞增殖(圖4B)。VE-cadherin的免疫熒光染色顯示,缺氧72小時后,VE-cadherin的完整性受到破壞(圖4D)。缺氧后,用10 mM乳酸鹽處理進一步破壞內皮細胞表面的VE-cadherin完整性(圖4D)。此外,WB和 qRT-PCR 分析顯示,與缺氧組相比,乳酸處理顯著降低VE-cadherin的水平(圖4C、5C),表明乳酸改變缺氧挑戰下內皮細胞的表型。用乳酸處理內皮細胞,檢測缺氧后EndoMT的標記物。如圖5A所示,缺氧72小時后,內皮細胞的形態從典型形狀變為拉長的紡錘形外觀。與缺氧對照組相比,乳酸處理導致細胞形態發生更大變化。此外,拉長細胞的FSP1染色呈陽性,CD31 染色呈陰性(圖5B)。圖5C顯示,缺氧挑戰后,乳酸減少VE-cadherin的表達并誘導α-SMA的釋放。進行基于Matrigel的內皮細胞血管生成試驗,發現乳酸的施用抑制缺氧誘導的血管生成(圖5D)。此外,利用膠原凝膠收縮試驗,證實乳酸處理的內皮細胞在缺氧刺激后表現出類似間充質的功能,這表現在膠原凝膠體積減小和收縮力增強(圖5E)??傊?,這些數據表明缺氧后乳酸誘導EndoMT。


    圖4. 缺氧后,乳酸誘導內皮細胞遷移并減少VE-cadherin的表達


    圖5. 缺氧后,乳酸促進內皮細胞中EndoMT


    6. 缺氧后乳酸激活TGF-β/Smad2信號傳導
           qRT-PCR顯示,在體內乳酸顯著加速MI后心肌中Tgfb1和Smad2 mRNA的表達(圖6A、B)。然而,乳酸鹽并沒有改變Smad3的mRNA水平(圖6C)。此外,2-DG抑制乳酸的產生降低MI誘導的Tgfb1和Smad2 mRNA表達(圖6D、E)。體外研究也表明,乳酸促進缺氧挑戰下的人臍帶內皮細胞(HUVECs)和HCMECs中TGFB1和SMAD2 mRNA 的表達(圖6F、G)。與基因表達水平一致,乳酸處理上調缺氧挑戰后Smad2的磷酸化和TGF-β的表達,但不影響 Smad3的磷酸化(圖6H)。這些數據綜合表明,乳酸誘導的TGF-β/Smad2激活有助于缺氧后的EndoMT。
                       


    圖6. MI/缺氧后,乳酸刺激TGF-β/Smad2信號傳導


    7. 抑制細胞內乳酸減輕缺氧誘導的EndoMT
           CHC[單羧酸鹽轉運體(MCT)抑制劑α-氰基-4-羥基肉桂酸鹽]降低乳酸處理誘導的細胞內乳酸水平(圖7A),表明細胞外乳酸是通過MCT 轉運到內皮細胞的。此外,服用CHC改善缺氧后乳酸促進的內皮細胞遷移(圖7B)。免疫熒光染色顯示,CHC阻乳酸處理導致的VE-cadherin表達減少(圖7C),而血管形成試驗表明,CHC促進缺氧后的血管生成(圖7D)。此外,CHC還緩解乳酸誘導的內皮標志物PECAM1、CDH5和KDR mRNA水平的降低(圖7E-G)以及間充質標志物ACTA2、FN1和COL1A1 mRNA水平的升高(圖7H-J)。用CHC處理抑制乳酸誘導的TGFB1和SMAD2 mRNA的表達(圖7K、L)。

     
    圖7. 抑制細胞內乳酸減弱缺氧誘導的EndoMT


    8. 缺氧后乳酸促進Snail1的核轉位
           如圖8A所示,單獨缺氧不會改變Snail1的胞漿表達。然而,與常氧狀態相比,缺氧后Snail1的核表達明顯加快。乳酸處理進一步上調Snail1的核轉位。免疫熒光染色顯示,缺氧后Snail1核表達的陽性率更高,而乳酸進一步誘導Snail1核表達(圖8B),表明Snail1的核轉位在乳酸促進的EndoMT中發揮重要作用。用抗Snail1抗體進行染色質免疫沉淀(ChIP)實驗,圖8C顯示,在缺氧挑戰的細胞中,Snail1與TGFB1 基因一起被大量招募。然而在乳酸處理的缺氧挑戰細胞中,TGFB1基因和Snail1蛋白之間的相互作用明顯大于缺氧細胞(圖8C)。這些數據表明,乳酸促進Snail1蛋白和TGFB1基因的相互作用,從而有助于TGF-β/Smad2介導的EndoMT。
    9. 缺氧后乳酸誘導Snail1乳酸化
           使用抗Snail1抗體進行免疫沉淀,然后使用抗泛乙酰賴氨酸(Kac)或抗泛乳酸賴氨酸(Kla)抗體進行免疫印跡,結果顯示缺氧誘導Snail1的乙?;腿樗峄?。給予乳酸進一步上調Snail1的乙?;腿樗峄▓D8D)。Snail1和CBP/p300之間存在相互作用,缺氧后乳酸處理促進它們之間的相互作用(圖8D)。然而,給予CHC抑制細胞內乳酸可減輕乳酸促進的Snail1和CBP/p300之間的相互作用,以及Snail1的乙?;腿樗峄▓D8E)。反過來,與缺氧組相比,乳酸處理也顯著增加抗CBP抗體、抗p300抗體、抗pan-Kla抗體和抗pan-Kac抗體免疫沉淀中Snail1的表達(圖8F)。相比之下,給予CHC可減少Snail1與CBP/p300 之間的相互作用以及Snail1的乳酸化和乙?;▓D8F)。


    圖8. 缺氧后,乳酸促進Snail1的核轉位和乳酸化


    10. 沉默Snail1減弱缺氧后的EndoMT和TGF-β/Smad2激活
           通過轉染特異性siRNA沉默Snail1逆轉缺氧后乳酸誘導的CD31和VE-cadherin下調(圖9A)。相反,抑制Snail1阻止乳酸促進的間充質標志物α-SMA 和FSP1的表達(圖9A)、SMAD2磷酸化和TGF-β激活(圖9H)。qRT-PCR觀察到在乳酸處理下,敲除Snail1提高PECAM1、KDR和CDH5的mRNA水平(圖9B-D),降低ACTA2、COL1A1和S100A4的mRNA水平(圖9E-G)。此外,沉默Snail1降低乳酸誘導的SMAD2和TGFB1 mRNA水平(圖9I、J)。


    圖9. 沉默Snail1減輕缺氧后的EndoMT和TGF-β/Smad2的激活


    11. 沉默Snail1改善MI后的心臟功能并減弱EndoMT
           如圖10(A和B)所示,與假手術組相比,MI顯著促進Snail1的乳酸化和乙?;?,以及Snail1與CBP/p300之間的相互作用。乳酸給藥進一步誘導它們之間的相互作用(圖10A)。用2-DG處理減輕MI誘導的Snail1與CBP或p300之間的相互作用,并減少Snail1乙?;腿樗峄▓D10B)。轉染特異性Snail1 siRNA,WB和免疫熒光染色證實,施用siSnai1顯著降低Snail1在心臟中的表達(圖10C、D)。然而,沉默Snail1逆轉乳酸降低的EF%和FS%水平(圖10E、F),并防止MI后乳酸誘導的LVEDV和LVESV水平升高(圖10G、H),表明Snail1的缺失改善乳酸誘導的心臟功能障礙。此外,與MI后乳酸處理相比,沉默Snail1提高Cdh5和Kdr mRNA的表達(圖10I、J),降低Acta2、Fn1和S100a4 mRNA的表達(圖10K-M),表明Snail1有助于MI后乳酸誘導的EndoMT。這些數據表明,Snail1通過激活TGF-β/Smad2信號在乳酸促進的EndoMT中發揮重要作用(圖10N)。        


    圖10. 沉默Snail1減輕MI后Snail1的乳酸化和EndoMT


    結論
           綜上所述,本研究發現乳酸發揮一種以前未知的功能,即在MI及缺氧后,乳酸通過激活TGF-β/ Smad2通路誘導EndoMT增加心臟纖維化并加劇心功能不全。這些發現加深了我們對乳酸在MI后EndoMT中作用的理解,并將成為開發創新療法以改善MI后心臟重塑和功能的基礎。

    實驗方法
    siRNA體內轉染,Masson三色染色,2,3,5-三苯基氯化四氮唑染色,2,3,5-三苯基氯細胞凋亡檢測,乳酸測定,流式細胞術,小鼠心臟內皮細胞的分離,細胞培養,增殖測定,血管生成試驗,膠原凝膠收縮實驗,免疫熒光,WB,qRT-PCR,免疫沉淀,ChIP-qPCR
    參考文獻
    Fan M, Yang K, Wang X, Chen L, Gill PS, Ha T, Liu L, Lewis NH, Williams DL, Li C. Lactate promotes endothelial-to-mesenchymal transition via Snail1 lactylation after myocardial infarction. Sci Adv. 2023 Feb 3; 9 (5): eadc9465. doi: 10.1126/ sciadv. adc9465. Epub 2023 Feb 3. PMID: 36735787; PMCID: PMC9897666.


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