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  • 脂肪自噬在糖尿病神經性疾病中發揮關鍵作用

    欄目:最新研究動態 發布時間:2023-11-27
    在本研究中揭示了高糖(HG)抑制脂肪自噬促進小膠質細胞內脂滴(LDs)和骨髓細胞表達的觸發受體1(TREM1)積累......



           糖尿病產生慢性炎癥和脂質代謝紊亂。小膠質細胞激活引起的神經炎癥和神經損傷是糖尿病相關認知障礙(DACI)的突出特征。在本研究中,作者揭示了高糖(HG)抑制脂肪自噬促進小膠質細胞內脂滴(LDs)和骨髓細胞表達的觸發受體1(TREM1)積累,積累的LDs與TREM1共定位反過來加劇HG誘導的脂肪自噬損傷,隨后通過NLRP3炎癥小體促進HG介導的神經炎癥級聯反應。而LP17對TREM1的藥理學阻斷抑制LD和TREM1積累,減少海馬神經元的炎癥損傷。該研究于2023年5月發表在《Autophagy》,IF:13.3。
    技術路線














    1. db/db小鼠和HFD/STZ小鼠海馬體小膠質細胞中LDs積累和脂肪自噬受損
           作者首先觀察到LDs在大腦皮層和海馬體中的積累顯著增加(圖1A)。用小膠質細胞標記物AIF1/IBA1、成熟星形膠質細胞標志物GFAP、神經元標記物RBFOX3/NeuN和PLIN2或BODIPY對冠狀腦切片進行免疫染色。作者觀察到LDs主要積累在小膠質細胞中,在星形膠質細胞和神經元中很少出現(圖1A,1B)。作者之后的分析主要集中在海馬體,因為它是評估認知功能的關鍵區域。瘦素受體缺陷(db/db)小鼠海馬體中增加的PLIN2+ LDs與AIF1+小膠質細胞主要集中在CA3區域(圖1A)。LDs免疫染色進一步證實增加的LDs主要分布在海馬體CA3區域的小膠質細胞中(圖1C)。
           透射電鏡結果顯示,db/db小鼠海馬體中LDs增加,脂肪自噬體減少(圖1D)。免疫染色結果顯示,在AIF1+海馬體小膠質細胞中,MAP1LC3B/LC3點顯著減少,而SQSTM1/p62點顯著富集(圖1E)。


    圖1:低密度脂蛋白在db/db小鼠海馬體小膠質細胞中積累和脂肪自噬受損


    2. HG抑制脂肪自噬促進LDs在體外小膠質細胞中積累
           作者用db/m和db/db小鼠收集的血漿處理BV2細胞。在db/db小鼠高血糖血漿處理的BV2細胞中,BODIPY陽性和PLIN2陽性的LDs顯著增加(圖2A)。接下來,作者使用含有不同濃度葡萄糖(5.5、25和50 mM)的DMEM培養基培養BV2細胞,并通過不同的培養時間點(24、48和72 h)來探索高糖是否在LDs積累中起關鍵作用。結果發現,在25和50 mM葡萄糖處理的BV細胞中觀察到LDs呈時間依賴性積累,并在培養72 h后達到積累峰值(圖2B)。因此,在接下來的體外實驗中,作者均采用25 mM葡萄糖培養72 h。作者發現db/db小鼠血漿(圖2C)和25 mM葡萄糖(圖2D)處理的BV2細胞中LC3B點減少和SQSTM1點增加,這暗示脂肪自噬的減少。透射電鏡結果也證實HG刺激BV2細胞中LDs積累和脂肪自噬損傷(圖2E)。
           然后,作者利用自噬抑制劑巴霉素A1(Baf)和活化劑雷帕霉素(RAPA)誘導BV2細胞。Baf顯著誘導LC3B-II和SQSTM1表達水平,表明HG抑制脂肪自噬的開始,而不是自噬-溶酶體融合階段(圖2F)。RAPA則恢復HG受損的脂肪自噬(LC3B-II增加和SQSTM1減少)和LDs積累(PLIN2減少)(圖2G),表明HG抑制脂肪自噬是LDs在BV2細胞中積累的原因。


    圖2:HG抑制脂肪自噬是LDs在小膠質細胞中積累的原因。


    3. T2DM老年患者血漿誘導人小膠質細胞HMC3中LDs積累并抑制脂肪自噬
           接下來,作者使用T2DM(2型糖尿?。├夏昊颊哐獫{和健康對照處理HMC3細胞進行體外實驗。血清糖化ALB是代表過去2-4周平均血糖水平的血糖監測指標,T2DM患者的血清糖化ALB水平顯著高于健康對照組(圖3A)。用高血糖血漿處理后,HMC3細胞中PLIN2+ HMC3細胞百分比顯著增加,以及SQSTM1點增加和LC3B點減少(圖3B和C)。PLIN2+ HMC3細胞數量與DSST評分呈負相關(P=0.029)(圖3D)。
           作者用5.5 mM和25 mM葡萄糖處理HMC3細胞,觀察到在HG處理的細胞中,PLIN2+ LDs和SQSTM1點數量顯著增加,而LC3B點數量減少(圖3E)。此外,HG誘導PLIN2和SQSTM1表達,并抑制LC3B-II的表達(圖3F)??傊?,研究結果表明,HG在體外和體內均損害小膠質細胞的脂肪自噬并觸發LDs積累。


    圖3: T2DM老年患者血漿誘導LDs在人HMC3細胞中積累并抑制親脂性


    4. HG培養和高血糖血漿培養的小膠質細胞以及db/db小鼠和HFD/STZ小鼠的海馬體小膠質細胞發生TREM1積累
           小膠質細胞中TREM和TREML受體是調節炎癥反應的關鍵受體。HG刺激后,HMC3(圖4A)和BV2細胞中TREM1和TREM2 mRNA水平均顯著降低。與mRNA降低水平相反,HG在HMC3細胞(圖4B)和BV2細胞中顯著誘導TREM1蛋白水平。接下來,作者發現db/db小鼠和db/m小鼠海馬體中TREM1 mRNA表達沒有顯著差異,但db/db小鼠海馬體中其蛋白表達明顯提高(圖4C)。免疫染色結果顯示,在BV2細胞(圖4D)和高血糖血漿處理的HMC3細胞(圖4E)中,TREM1+細胞百分比顯著增加。此外,TREM1+ HMC3細胞百分比與DSST評分呈負相關(P=0.00008)(圖4E)。作者對T2DM點和對照小鼠腦切片進行免疫染色,發現在db/db和高脂肪飲食與STZ(HFD/STZ)小鼠海馬體中,增加的TREM1與AIF1+小膠質細胞共染色(圖4F)。


    圖4:高血糖血漿或HG培養的小膠質細胞和db/db小鼠海馬體小膠質細胞中TREM1蛋白水平升高


    5. 體內外小膠質細胞中HG誘導TREM1與LDs共定位
           用T2DM患者血漿或HG培養后,TREM1點主要富集或重疊在HMC3細胞PLIN2+ LDs中(圖5A和B)。在高血糖血漿培養的HMC3細胞中,TREM1簇和PLIN2+ LDs共定位顯示出不同形態。如圖5C所示,TREM1位于PLIN2+ LDs相鄰區域(頂板),或部分重疊于PLIN2+區域(第二面板),或完全被PLIN2+ LDs吞沒(第三面板)。此外,正在進行融合的LDs中也觀察到TREM1簇富集。db/db小鼠血漿培養的BV2細胞中也觀察到這些不同形態(圖5D)。在db/db和HFD/STZ小鼠海馬體小膠質細胞中,還檢測到TREM1與PLIN2+ LDs共定位(圖5E)。
           接下來,作者對HMC3細胞進行co-IP,證實TREM1和PLIN2在HG環境中發生相互作用(圖5F)。在HG處理的細胞中添加RAPA后,TREM1及其下游蛋白磷酸化脾臟酪氨酸激酶(SYK)表達顯著下降(圖5C)。這些發現表明,HG誘導TREM1與積累的LDs共定位可能有助于體內外小膠質細胞中TREM1的積累。


    圖5:HG在體內和體外誘導小膠質細胞中TREM1與LDs共定位。


    6. HG刺激的小膠質細胞中TREM1通路抑制挽救脂肪自噬受損和LDs積累
           TREM1在自噬中起關鍵作用。作者探索了HG誘導TREM1共定位以及隨后TREM1高水平表達是否會反過來影響小膠質細胞脂肪自噬和LDs積累(圖6A)。BV2細胞中TREM1經shRNA敲除顯著降低磷酸化SYK表達,如LC3B-II水平增加以及SQSTM1和PLIN2水平降低所示(圖6B),HG誘導的親脂性損傷和LDs積累減少。然后用TREM1特異性抑制肽LP17共同處理HG誘導的BV2細胞。如圖6C所示,LP17給藥顯著減少HG誘導的SQSTM1點和PLIN2點聚集,并恢復HG在BV2細胞中誘導的磷酸化SYK、LC3B-II、SQSTM1和PLIN3表達(圖6D)。在HG誘導的HMC3細胞(圖6E和F)中觀察到LP17類似作用,這表明抑制TREM1可以恢復HG刺激小膠質細胞中脂肪自噬損傷和LDs積累。


    圖6:TREM1抑制恢復HG刺激的小膠質細胞中脂肪自噬損傷和LDs積累


    7. db/db模型和HFD/STZ模型中TREM1的藥理學阻斷改善認知功能
           接下來,作者驗證TREM1在db/db模型和HFD/STZ認知障礙模型中的生物學功能。db/db和HFD/STZ小鼠腹膜內注射LP17。LP17給藥2周后,通過Morris Water Maze(MWM)測試評估每只db/db小鼠的認知功能。LP17給藥顯著改善db/db小鼠平臺穿越時間和在目標象限中花費的時間(圖7A)。且注射LP17期間,平均游泳速度沒有顯著差異(圖7B)。作者還評估了海馬體神經元凋亡和突觸可塑性。LP17給藥顯著減少db/db小鼠海馬體中TUNEL+(末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP生物素缺口末端標記)凋亡神經元數量。給予LP17顯著恢復db/db小鼠海馬體中下調的DLG4(突觸后標志物)表達水平(圖7C)。關于LP17對神經炎癥的影響,在接受LP17的db/db小鼠中,促炎因子(NOS2、TNF、IL6和IL1B)產生顯著降低(圖7D)。最后,作者發現LP17顯著減少db/db小鼠海馬體CA3區域小膠質細胞中LDs積累,并促進細胞親脂性,這與作者的體外結果一致(圖7E和F)。


    圖7: db/db模型中TREM1經藥物阻斷能夠改善認知功能,減少海馬體神經元變性,抑制小膠質細胞炎癥


    結論
           HG抑制的脂肪自噬是小膠質細胞內LDs積累的原因。LDs積累與小膠質細TREM1共定位,導致小膠質細胞TREM1積累,反過來加劇HG誘導的脂肪自噬損傷,隨后通過NLRP3炎癥小體促進HG介導的神經炎癥級聯反應。此外,在db/db小鼠和HFD/STZ小鼠中,LP17可藥理學阻斷TREM1從而抑制LDs和TREM1的積累,減少海馬體神經元炎癥損傷,從而改善認知功能。

    實驗方法
    免疫染色,透射電鏡,MWM測試,TUNEL評估,細胞體外培養,RT-qPCR,Western blotting ,Co-IP,ELISA,ROS試驗
    參考文獻
    Li Q, Zhao Y, Guo H, Li Q, Yan C, Li Y, He S, Wang N, Wang Q. Impaired lipophagy induced-microglial lipid droplets accumulation contributes to the buildup of TREM1 in diabetes-associated cognitive impairment. Autophagy. 2023 May 19:1-18. doi: 10.1080/15548627.2023.2213984. Epub ahead of print. PMID: 37204119.


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