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  • p53 GOF突變體與ERG通過β-Catenin激活和嘧啶合成促進前列腺癌

    欄目:最新研究動態 發布時間:2023-11-23
    在本研究中,作者確定p53功能獲得(GOF)突變體基因的反式激活功能,并揭示β-Catenin是p53 GOF突變體的轉錄靶基因......



           TP53腫瘤抑制基因是人類癌癥中最常見的突變基因。在約50%的前列腺癌癥(PCa)患者中會發生ETS相關基因(ERG)與TMPRSS2基因融合。在本研究中,作者確定p53功能獲得(GOF)突變體基因的反式激活功能,并揭示β-Catenin是p53 GOF突變體的轉錄靶基因,也是TMPRSS2-ERG和p53 GOF突變體陽性PCa驅動和治療靶點。該研究于2023年8月發表在《nature communications》,IF:16.6。
    技術路線














    1. 前列腺腫瘤中TMPRSS2- ERG轉基因與Trp53缺失協同和p53 GOF突變體的作用
           在TCGA數據與轉移性PCa SU2C隊列數據中,作者確定TMPRSS2-ERG融合與TP53失活在前列腺癌患者中同時發生(圖1a,b)。
           作者以前列腺特性(Pb)驅動的Cre重組酶轉基因小鼠(Pb-Cre4)、Pb-TMPRSS2-ERG(T2-ERG)轉基因小鼠、Trp53loxp-top-loxp-R172H/loxp小鼠為基礎,共產生六組基因工程小鼠(GEM):(1)野生型(WT)對照;(2) 前列腺細胞特異性T2-ERG轉基因(Pb-T2-ERG);(3)前列腺細胞特異性Trp53敲除(Pb-Cre+;Trp53p/p或Trp53pc-/-);(4)前列腺細胞特異性Trp53敲除和R172H突變體敲入(Pb-Cre+;Trp53R172H/p或Trp53pcR172H/-);(5)前列腺細胞特異性T2-ERG轉基因和Trp53敲除(Pb-Cre+;Pb-T2-ERG;Trp53p/p或Pb-T2-RG;Trp53pc-/-);(6)前列腺細胞特異性T2-ERG轉基因和Trp53敲除/敲入(Pb-Cre+;Pb-T2-ERG;Trp53R172H/p或Pb-T2-RG;Trp53pcR172H/-)(圖1c)。TP53 R175H被認為是GOF突變。TMPRSS2-ERG過表達和Trp53缺失誘導10月齡Trp53pc-/-小鼠局灶性低前列腺上皮內瘤變(LGPIN)和約50% 15月齡小鼠高PIN(HGPIN)和局灶性腺癌(圖1c,d)。重要的是, PbT2 ERG';Trp53pcR172H/-小鼠在10月齡時發展為HGPIN和腺癌,約90%小鼠在15個月齡時發展為侵襲性HGPIN和/或腺癌(圖1c,d)。值得注意的是, IHC結果顯示,這些癌癥和PIN病變均為雄激素受體(AR)陽性(圖1c)。與之前的報道一致,在10月齡Pb-T2-ERG小鼠中未觀察到PIN;然而,20%的小鼠在15月齡時出現局灶性LGPIN病變(圖1d)。作者所觀察到的年齡依賴性疾病發展進一步支持ERG過表達通過與其他基因改變協同促進前列腺腫瘤發生。在Pb-T2-ERG;Trp53pc-/-和Pb-T2-ERG;Trp53pcR172H/-小鼠兩個年齡段中,組織學變化與增加的Ki67染色一致。
           除R175H突變,在人前列腺癌細胞系VCaP(TMPRSS2-ERG(ERGΔN39)/TP53R248W/-DBD突變體陽性)中,作者證明ERG或p53 DNA結合域(DBD)突變體單獨敲除或雙敲除抑制VCaP細胞生長(圖1g,h)??傊?,這些數據表明,小鼠Trp53中R172H和人TP53中R248W等突變分別作為GOF突變驅動小鼠前列腺腫瘤發生和人前列腺癌細胞生長。


    圖1:TMPRSS2-ERG融合和TP53失活協同誘導小鼠前列腺腫瘤發生


    2. ERC與p53 GOF突變體上調PSGs
           作者對六組GEM的前列腺組織進行RNA-seq分析。RNA-seq數據顯示,來源于Pb-T2-ERG;Trp53pc-/-小鼠和Pb-T2-ERG;Trp53pcR172H/- PIN病變的前列腺腫瘤共享有370個上調基因,各自有901個和304個獨特上調靶點(圖2a)。通過對這組基因數據和先前報道的GEM模型中TMPRSS2-ERG前列腺腫瘤產生的ERG ChIP-seq數據整合分析,作者從Pb-T2-ERG;Trp53pcR172H/-小鼠中鑒定出531個前列腺腫瘤中高度上調的ERG靶基因(圖2b,c)。IPA分析表明,這些基因中多數與癌癥相關(圖2d)。與來自對照組小鼠的前列腺組織相比,PSGs亞群,包括Umps、Rrm1、Rrm2 和 Tyms在Pb-T2-ERG;Trp53pcR172H/-腫瘤中上調(圖2a,c-g)。這些結果通過Pb-T2-ERG;Trp53pcR172H/-小鼠腫瘤RT-qPCR進一步得到驗證(圖2h,i)。這些數據表明,p53 GOF突變體與T2-ERG協同上調前列腺癌PSG表達。


    圖2:ERG和p53GOF突變體對GEM前列腺腫瘤和人前列腺癌細胞系嘧啶合成基因的協同調控


    3. CTNNB1被鑒定為p53 GOF突變體的轉錄靶基因
           為確定p53 GOF突變體是否通過與PSG基因組位點結合來調節PSG表達,作者使用抗p53抗體在VCaP細胞中進行p53 ChIP-seq。共鑒定到1116個與p53 GOF突變體R248W顯著結合的峰(P<1E-10),這些峰定位于啟動子和非啟動子區域,并與615個基因相關(圖3a)。但在VCaP細胞中沒有檢測到p53 GOF突變體R248W與典型p53靶基因的結合,也沒有檢測到R248W在PSG上的結合位點。這表明p53 GOF突變體間接調控PSG表達。
           為明確介導p53 GOF突變體調控PSG表達的下游效應因子,作者對p53突變體R248W結合基因進行GO分析,發現其富集于轉錄共調節因子結合途徑(圖3b),并在CTNNBI基因啟動子中檢測到R248W結合峰,該基因編碼β-Catenin (圖3c)。在VCaP細胞中通過ChIP-qPCR進一步驗證該結果(圖3d)。
           接下來,作者對p53 R248W ChIP qPCR進行分析(圖3e)。他們發現R248W突變體特異性占據VCaP細胞中ChIP-seq峰的中心(圖3e,f)。使用VCaP細胞裂解物和生物素標記的雙鏈DNA探針進行電泳遷移率偏移測定(EMSA)確定突變型p53結合序列(MP53BS)(圖3e)。在測定中添加競爭性未標記探針或抗p53抗體,MP53BS探針的EMSA信號顯著減弱(圖3h,i)。另外,作者還證實,p53所有DBD突變體都與MP53BS探針結合(圖3j),表明p53 DBD突變體直接與CTNNB1啟動子的MP53BS結合。
           作者使用CRISPR/Cas9敲除了DU145細胞中CTNNB1啟動子MP53BS序列并產生4個MP53BS敲除克隆。在這4個克隆當中,CTNNB1 mRNA和β-Catenin表達均顯著下調(圖3k,l)。雖然p53 GOF突變體敲除顯著降低對照DU145細胞中β-Catenin mRNA和蛋白質表達,但它未能進一步降低MP53BS KO細胞中β-Catenin表達(圖3m,n)。這些數據表明β-Catenin是p53 GOF突變體的調節靶點,并通過CTNNB1啟動子中MP53BS介導。


    圖3:GOF突變體p53與啟動子結合并反式激活CTNNB1基因表達


    4. TMPRSS2-ERG與p53 GOF突變體協調β-Catenin表達
           RNA-seq與RT-qPCR結果顯示,Ctnnb1 mRNA在Pb-T2-ERG;Trp53pcR172H/-小鼠前列腺腫瘤中上調(圖4a,b,c)。CTNNB1 mRNA僅在SU2C隊列的ERG融合和TP53突變雙陽性患者樣本中顯著上調(圖4d)。作者不僅發現ERG與CTNNB1啟動子結合,而且還鑒定出MP53BS相鄰的ERG結合序列(ERGBS)(圖4e)。ChIP和re-ChIP證實突變型p53和ERG與VCaP細胞中CTNNB1啟動子同一區域結合(圖4f)。VCaP細胞中ERG敲低下調CTNNB1 mRNA和β-Catenin蛋白水平(圖4g,h),支持GOF突變型p53在調節PCa細胞β-Catenin表達中的主要作用。通過敲低VCaP細胞中ERG或p53突變體,降低了H3K27Ac(基因轉錄的活性標記物)在CTNNB1啟動子處的富集(圖4i)。螢光素酶報告基因分析結果顯示,CTNNB1啟動子活性通過不同的p53 GOF突變體單獨表達而增加,而不是通過單獨表達ERG;然而,p53突變體和ERG共表達顯著增強啟動子活性(圖4j)。這些數據表明TMPRSS2-ERG與p53 GOF突變體協同調節PCa細胞中CTNNB1表達。


    圖4:ERG和GOF突變型p53共調節β-Catenin表達


    5. TMPRSS2-ERG與β-Catenin協調PSG表達
           β-Catenin與PSG的啟動子和/或非啟動子區域結合,包括UMPS、RRM1、RRM2和TYMS(圖5a)。ChIP-qPCR進一步證實ERG和β-Catenin在這些基因座的啟動子或增強子上的存在(圖5b,c)。
           β-Catenin單獨敲低抑制VCaP細胞中PSG mRNA和蛋白表達(圖5d,e),ERG或p53 R248W敲低則不會導致PSG mRNA和蛋白在β-Catenin缺失細胞系中進一步降低表達(圖5d,e)。
           作者敲低VCaP細胞中內源性ERGΔN39和p53突變體R248W,并測定嘧啶合成的三個關鍵中間體UMP、dTTP和dTDP水平(圖2e)。UMPS、RRM1和RRM2這三種嘧啶合成的關鍵酶單獨或同時耗竭(圖2e)在很大程度上抑制VCaP細胞生長(圖5i,j)。同時,作者證明Dox誘導的PSG敲低在很大程度上抑制了小鼠中VCaP腫瘤生長(圖5k,l)。Dox給藥也降低了腫瘤重量(圖5m)。這些數據表明,ERG和p53突變體誘導上調關鍵的PSG,如UMPS、RRM1和RRM2,這對于體外體內TMPRSS2-ERG和p53突變體雙陽性PCa細胞的生長很重要。


    圖5:ERG與β-Catenin共占據PSG位點并共調控其表達


    6. β-Catenin抑制劑在體內體外抑制PSG表達與TMPRSS2-ERG/ p53突變體陽性PCa細胞生長
           ICG-001與PRI-724是β-Catenin抑制劑。這兩種藥物在p53突變體R248W陽性VCaP細胞中表現出更強的生長抑制作用(圖6a,b)。ICG-001處理VCaP細胞降低了PSG 表達,以及β-Catenin靶基因CCND1和c-MYC mRNA和蛋白水平的表達,并以劑量依賴性方式抑制細胞生長(圖6c–e)。用PRI-724處理VCaP細胞也獲得了類似的結果(圖6f–h)。接下來,作者在體內檢測了β-Catenin抑制劑ICG-001的抗癌作用。ICG-001給藥顯著抑制了小鼠VCaP異種移植物腫瘤生長(圖6i–k)。IHC顯示,ICG-001處理降低了嘧啶合成酶如UMPS、RRM1和Ki67的表達,但沒有降低CREB結合蛋白(CBP)表達(圖6l,m)。


    圖6:β-Catenin抑制劑抑制PSG表達和小鼠PCa異種移植物生長


    7. β-Catenin-LEF/TCF是TMPRSS2-ERG/ p53突變體陽性
           β-Catenin通過與DNA結合伴侶LEF/TCF家族蛋白(包括LEF1、TCF1、TCF3和TCF453)形成蛋白質復合物來反式激活靶基因。作者最近報道基于寡核苷酸的PROTACs(O’PROTACs或OP)開發,以靶向LEF1進行蛋白質破壞。有效的LEF1 O’PROTAC(OP-V1)幾乎完全溶解VCaP細胞中LEF1蛋白。這種O’PROTAC也在一定程度上下調TCF3和TCF4蛋白,這與LEF/TCF蛋白家族成員共享相似核心DNA靶序列(例如TCAAAG)觀察結果一致(圖7a,b)。重要的是,這種LEF1/TCF OP還抑制關鍵嘧啶合成酶蛋白質表達和培養中VCaP細胞生長(圖7b,c)。據報道,LuCaP 23.1 PDX及其雄激素依賴(去勢抗性)亞系LuCaP 23.1AI是TMPRSS2-ERG基因融合陽性,并且TP53缺失一個等位基因。與LuCaP 23.1AI報道一致,作者證實親代LuCaP 23.1-PDX腫瘤在p53 DBD中也存在C238Y突變(圖7d)。突變型p53 C238Y與CTNNB1啟動子MP53BS結合(圖3j),shRNA敲低該突變型可顯著降低LuCaP 23.1 PDX衍生的類器官(PDXO)中β-Catenin表達(圖7e)。
           作者證明,LEF1/TCF OP處理不僅抑制關鍵嘧啶合成酶蛋白表達,而且有抑制LuCaP 23.1 PDXO生長(圖7f–h)。補充dTTP/dCTP幾乎完全逆轉這種作用,但補充dATP/dGTP脫氧核苷三磷酸鹽沒有顯著效果(圖7g,h)。LEF1/TCF OP處理顯著阻礙LuCaP 23.1 PDX腫瘤的生長,而不會導致小鼠體重發生降低(圖7i–l)。ILEF1/TCF-OP不僅降低LEF/TCF蛋白和嘧啶合成酶如UMPS和RRM1表達水平,而且減少了Ki67陽性細胞數量(圖7m,n)。這些結果表明,O’PROTAC通過靶向LEF/TCF蛋白抑制β-Catenin和PSG表達,體內外有效阻斷了TMPRSS2-ERG和GOF-p53突變陽性PCa生長。


    圖7:LEF1/TCF O 'PROTAC抑制PSG表達和TMPRSS2- ERG和突變型p53陽性PCa PDX腫瘤生長


    結論
           在本研究中,作者確定p53 GOF突變體基因的反式激活功能,并揭示β-Catenin是p53 GOF突變體的轉錄靶基因,也是TMPRSS2-ERG和p53 GOF突變體陽性PCa驅動和治療靶點。

    實驗方法
    IHC,CRISPR/Cas9,RT-qPCR,Western blot,RNA-seq
    參考文獻
    Ding D, Blee AM, Zhang J, Pan Y, Becker NA, Maher LJ 3rd, Jimenez R, Wang L, Huang H. Gain-of-function mutant p53 together with ERG proto-oncogene drive prostate cancer by beta-catenin activation and pyrimidine synthesis. Nat Commun. 2023 Aug 3;14(1):4671. doi: 10.1038/s41467-023-40352-4. PMID: 37537199.


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