<dd id="fncnt"><pre id="fncnt"></pre></dd>

  • 已確認:索拉菲尼誘導胃癌細胞鐵死亡

    欄目:最新研究動態 發布時間:2023-11-15
    關于鐵死亡和ATF2之間關系的信息非常有限,且ATF2在索拉非尼誘導的鐵死亡中的作用尚未被研究......

           索拉非尼是一種酪氨酸激酶抑制劑,在包括胃癌(GC)在內的多種癌癥中作為鐵死亡誘導劑具有重要的抗腫瘤作用。然而,最近索拉非尼作為鐵死亡誘導劑的狀態受到質疑。關于鐵死亡和ATF2之間關系的信息非常有限,且ATF2在索拉非尼誘導的鐵死亡中的作用尚未被研究。在本文中,作者探討了GC中ATF2在索拉非尼誘導的鐵死亡中的作用及其相關分子機制。本文于2023年1月發表在《Redox Biology》IF:11.4期刊上。

    技術路線


    主要實驗結果
    1、ATF2在胃癌中表達上調并預示不良預后

           TCGA數據庫顯示與正常組比較,ATF2 mRNA表達在腫瘤中顯著上調(圖1A)。此外,與正常細胞系GES-1比較,GC細胞系中ATF2的蛋白表達顯著上調(圖1B),該結果被臨床12對癌與癌旁的檢測結果所驗證(圖1C)。使用IHC檢測了107例GC組和22例正常組織中ATF2的表達,代表性圖像見圖1D,結果發現GC組織中61.7%的樣本ATF2高表達,而癌旁中63.6%的樣本ATF2低表達(圖1E)。結合患者預后的生存分析顯示ATF2高表達組的總體生存期顯著下降(圖1F)。KM數據庫得出了類似的結論(圖1G)??傊?,ATF2在GC中表達上調并預示不良預后。


    圖1 ATF2在GO中上調且預測不良預后


    2、ATF2促進GC細胞惡性表型
           如圖2所示,在GC細胞中敲低ATF2后顯著抑制細胞的增殖遷移和侵襲,過表達ATF2則相反,表明ATF2促進GC細胞惡性表型。


    圖2 ATF2敲低抑制GC細胞惡性表型


    3、索拉非尼誘導GC細胞鐵死亡
           由于先前的研究表明索拉非尼誘導鐵死亡的不確定性,作者首先探究了索拉菲尼是否誘導GC細胞鐵死亡。如圖3A所示,索拉菲尼處理細胞24h后,AGS和MGC-803細胞形態呈現出收縮,變圓,排列松散,而同時使用鐵死亡抑制劑Fer-1處理則可反轉這種效果。與對照組相比,索拉非尼處理導致總細胞ROS和脂質ROS均顯著增加(圖3B-C),并且導致MDA水平增加(圖3D),GSH水平下降(圖3E),然而Fer-1處理抑制上述效果。


    圖3 索拉非尼誘導AGS和MGC-803細胞鐵死亡


           鑒于鐵死亡與線粒體功能息息相關,因此,作者進一步檢測了索拉菲尼對MMP和線粒體形態的影響。JC-1染色結果顯示,與對照組比較,索拉菲尼顯著減低AGS和MGC-803細胞MMP(圖4A)。此外,TEM顯示索拉菲尼處理的MGC803細胞線粒體嵴明顯減少或缺失,線粒體膜密度增加(圖4B)。這些結果表明索拉非尼可以誘導GC細胞的鐵死亡。
           作為一種關鍵的應激反應轉錄因子,ATF2在索拉非尼誘導的鐵死亡中的表達變化尚不清楚。如圖4C所示,索拉非尼處理增加ATF2的表達,尤其是磷酸化形式。免疫熒光顯示,索拉非尼刺激后ATF2在細胞核中的表達更高(圖4D)。因此,索拉非尼誘導的鐵死亡可能會促進ATF2的核轉位并增強ATF2在GC細胞中的轉錄活性。


    圖4 索拉非尼處理增加GC細胞中ATF2的表達并促進其核易位


    4、ATF2敲低抑制索拉菲尼誘導的GC細胞鐵死亡
           如圖5A所示,敲低ATF2導致GC細胞的IC50下降,過表達則相反。此外,索拉菲尼和ATF2敲低均顯著增加細胞內總ROS和脂質ROS含量,而兩者同時進行則進一步促進其增加,但是,索拉菲尼處理同時過表達ATF2則顯著回落ROS的水平(圖5B-C)。類似的,過表達ATF2可顯著逆轉因索拉菲尼處理引起的MDA增加(圖5D)和GSH下降(圖5E),以及線粒體形態改變(圖5F)。這些發現表明ATF2過表達抑制索拉非尼誘導的GC細胞鐵死亡。


    圖5 ATF2敲低抑制索拉菲尼誘導的GC細胞鐵死亡


    5、ATF2在GC細胞中激活HSPH1的轉錄
           為進一步闡明ATF2的潛在機制,進行RNA-seq和ChIP-seq分析,以鑒定ATF2的全基因組DNA結合位點和潛在轉錄靶點。如圖6A所示,RNA-seq分析顯示,與對照組相比,MGC803細胞中ATF2敲除后,1059個基因上調,370個基因下調。重要的是,RNA-seq數據的通路富集分析表明,ATF2敲除明顯影響鐵死亡通路(圖6B)。ChIP-seq共鑒定出24119個峰,對應3641個RefSeq基因,其中2.88%位于啟動子-轉錄起始位點(圖6C)。在染色體上觀察到了不同的峰值,并掃描了峰值之間共享的motifs(圖6D和E)。


    圖6 RNA-seq和ChIP-seq鑒定ATF2的全基因組DNA結合位點和轉錄靶點


           然后對RNA-seq和ChIP-seq數據進行交叉分析,篩選出222個受ATF2直接調控的候選轉錄靶標(圖7A)。其中,HSPH1在ATF2敲除后顯著下調(圖7B)。此外,在TCGA數據集中,HSPH1在GC中的表達與ATF2呈顯著正相關(圖7C)。如圖7D所示,ChIP-seq數據顯示在HSPH1的啟動子區域有明顯的ATF2結合峰。因此,推測HSPH1可能是ATF2的潛在靶基因。WB分析結果顯示,HSPH1在ATF2過表達后增加,而在ATF2敲除后減少(圖7E)。此外,ChIP-qPCR進一步證實ATF2可以結合到HSPH1的啟動子區域(圖7F)。這些數據表明ATF2可以通過與HSPH1啟動子結合來激活HSPH1的表達。


    圖7 ATF2與HSPH1啟動子結合激活其轉錄


    6、HSPH1與SLC7A11結合并增加其穩定性
           鑒于一些研究報道了HSP蛋白在鐵死亡中的突出作用,作者試圖確定HSPH1是否可能影響SLC7A11在GC中的表達。首先查詢了GeneMANIA數據庫,其預測并顯示了HSPH1和SLC7A11之間潛在的相互作用(圖8A)。為驗證這一預測,進行co-IP實驗,確定HSPH1與SLC7A11存在物理相互作用(圖8B)。接下來,采用siRNA敲除HSPH1的表達(圖8C),并將HSPH1 siRNA轉染到ATF2穩定過表達的AGS細胞中。觀察到HSPH1的敲除降低了SLC7A11的蛋白表達水平,但沒有降低mRNA水平(圖8D)。因此,進行了CHX試驗,以確定在HSPH1敲除或未敲除的情況下SLC7A11蛋白的半衰期。WB分析表明,與對照組相比,抑制HSPH1加速了AGS細胞中SLC7A11蛋白的降解(圖8E)。這些結果表明,HSPH1可以與SLC7A11相互作用,并至少部分地通過增加SLC7A11蛋白的穩定性來增加其表達。
           敲除HSPH1可以部分消除ATF2過表達對細胞ROS和脂質ROS的影響(圖8F和G)。同樣,與HSPH1 siRNA共轉染可顯著逆轉ATF2過表達對鐵死亡細胞MDA和GSH水平的影響(圖8H和I)。這些結果為ATF2通過HSPH1調控索拉非尼誘導的GC細胞鐵死亡提供了證據。


    圖8 HSPH1與SLC7A11結合并增加其穩定性


    7、ATF2敲低增加小鼠GC腫瘤對索拉菲尼的敏感性
           最后,為評估ATF2單獨敲除和與索拉非尼聯合敲除對體內GC的影響,建立了裸鼠異種移植模型(圖9A)。與對照組相比,穩定敲除ATF2細胞形成的腫瘤體積更小,重量更輕,表明ATF2敲除可以有效抑制體內腫瘤的生長(圖9B)。此外,索拉非尼治療后,皮下腫瘤的體積和重量均顯著進一步下降(圖9C和D)。表明ATF2敲除聯合索拉非尼治療對腫瘤生長的抑制作用最強。為更好地觀察潛在的鐵死亡,皮下腫瘤切片被4-HNE染色,4-HNE是一種敏感的脂質過氧化標記物。IHC染色顯示sh-ATF2+索拉非尼組4-HNE表達最高(圖9E)。因此,ATF2敲除可增強索拉非尼對體內GC的抗腫瘤作用。


    圖9 ATF2敲低增加小鼠GC腫瘤對索拉菲尼的敏感性


           總之,作者發現索拉非尼激活ATF2的表達,并進一步促進HSPH1的表達,減少SLC7A11蛋白的降解,從而導致了對脂質過氧化的保護(圖10)。因此,以ATF2/HSPH1軸為靶點增強索拉非尼誘導的鐵變態反應是一種有吸引力的GC治療策略。


    圖10 圖像摘要


    實驗方法
    臨床收集福爾馬林固定石蠟包埋的GC樣本,細胞培養,WB,qRT?PCR,免疫組織化學染色,細胞增殖曲線,半數抑制濃度(IC50)實驗,Transwell遷移和侵襲實驗,Calcein-AM/PI染色,細胞內ROS和脂質過氧化檢測,MDA和GSH檢測,線粒體膜電位(MMP)檢測,透射電鏡實驗(TEM),RNA測序,染色質免疫共沉淀(ChIP)測序,ChIP-qPCR,co-IP,蛋白質穩定性實驗,小鼠腫瘤模型
    參考文獻
    Xu X, Li Y, Wu Y, Wang M, Lu Y, Fang Z, Wang H, Li Y. Increased ATF2 expression predicts poor prognosis and inhibits sorafenib-induced ferroptosis in gastric cancer. Redox Biol. 2023 Feb;59: 102564. doi: 10.1016/j.redox.2022.102564. 


    999国产精品永久免费视频,free性朝鲜娇小videos,亚洲高清国产拍精品26u,东北女人毛多水多牲交视频