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  • 靶向m7G-SLUG/SNAIL軸——在射頻消融不足后阻斷肝細胞癌轉移

    欄目:最新研究動態 發布時間:2023-11-14
    本研究中發現,METTL1 介導的 m7G tRNA修飾在體外和體內亞致死熱應激下促進HCC轉移......



           射頻熱消融是治療肝細胞癌(HCC)的理想根治方法。然而,不充分的射頻消融(IRFA)可能會導致肝癌的高復發率。在哺乳動物和酵母中,tRNA上的N7 -甲基鳥苷(m7G)是一種進化上保守的修飾,可調節熱應激反應和腫瘤進展,但它在IRFA后HCC復發中的功能仍不清楚。本研究中,作者發現METTL1 介導的 m7G tRNA修飾在體外和體內亞致死熱應激下促進HCC轉移。機制上,METTL1介導的m7G tRNA修飾以依賴于密碼子頻率的方式選擇性調控上皮-間充質轉化(EMT)過程中關鍵基因SLUG/SNAIL的翻譯。該研究于2023年6月發表在《Molecular Therapy》,IF:12.4。
    技術路線



    主要研究結果
    1. HCC中亞致死熱應激促進METTL1表達和m7 G修飾
           建立IRFA或HCC患者異種移植(PDX)小鼠模型,以高精度模擬臨床HCC 消融。使用紅外成像儀監測腫瘤過渡區(TZ)在41℃-50℃范圍內遭受亞致死性熱應激時的溫度(圖1A)。結果發現,IRFA 顯著上調了TZ中m7G tRNA 修飾水平以及METTL1和WDR4的表達(圖1B-1D)。METTL1 和 WDR4 在非腫瘤組織中的水平較低,但在RFA治療后復發的HCC組織中的水平顯著升高(圖1E和1F)。亞致死性熱處理可顯著上調HCC患者衍生的類器官組織中METTL1 和WDR4的表達(圖1G和1H)。在亞致死熱應激HCC細胞模型中驗證亞致死熱處理會增加HCC細胞中m7G tRNA的修飾及METTL1/WDR4 的水平(圖1I和1J)。這些數據表明,IRFA誘導的m7G tRNA 修飾上調可能與HCC在RFA 期間的耐熱性有關。


    圖1. 暴露于亞致死熱應激下的HCC中m7G tRNA修飾和METTL1/WDR4水平升高


    2. 敲降METTL1抑制亞致死熱應激下HCC細胞的惡性行為
           鑒于亞致死熱應激會增加m7G tRNA的修飾和METTL1/WDR4的表達,作者推測METTL1 可能在亞致死熱應激下發揮重要的致癌功能。northwestern blot(圖2A)證明METTL1 基因敲低降低tRNA的m7G修飾。亞致死熱應激顯著抑制HCC細胞的生長(圖2B)、克隆形成能力(圖2C、2D)和細胞周期進展(圖2E),而 METTL1 的缺失進一步抑制亞致死熱處理下HCC細胞的生長和克隆形成。另一方面,亞致死熱應激會誘導HCC細胞凋亡,當 METTL1 被沉默時,這一趨勢更加明顯(圖2F)。此外,亞致死熱處理顯著促進三種HCC細胞的遷移和侵襲能力,但METTL1沉默會顯著削弱這一趨勢(圖2G-2J)。這些數據表明,METTL1 在亞致死熱應激下對HCC的惡性特征起著重要作用。


    圖2. 敲低METTL1抑制亞致死熱應激下HCC細胞的惡性行為


    3. 過表達METTL1以m7G tRNA 修飾依賴的方式促進HCC細胞在亞致死熱應激后的惡性能力
           在HCC細胞中過表達野生型(oeWT)及其無催化活性突變體(oeMUT)METTL1。與oeNC 相比,在含有oeWT METTL1 而非oeMUT METTL1的HCC 細胞中觀察到tRNA 中m7G修飾水平增加(圖3A)。在正常培養條件下,oeWT METTL1 顯著促進HCC細胞生長(圖3B)、克隆形成(圖3C、3D)、遷移(圖3E、3F)和侵襲(圖3G、3H)。然而,過表達無催化活性突變體METTL1 對HCC的進展影響甚微(圖3B-3H)。同樣,在亞致死熱處理條件下,過表達 WT METTL1 而非突變體METTL1顯著促進HCC細胞的惡性發展(圖3B-3H)。這些數據表明,在亞致死性熱應激下,METTL1以m7G tRNA甲基轉移酶活性依賴的方式對HCC細胞惡性化至關重要。


    圖3. 過表達METTL1以m7G tRNA 修飾依賴的方式促進HCC細胞在亞致死熱應激后的惡性能力


    4. 亞致死熱應激通過METTL1-m7G 介導的翻譯控制機制提高HCC細胞的惡性潛能
           TRAC-seq結果顯示,亞致死熱處理后,HCC細胞中的tRNA m7G修飾顯著上調(圖4A、4B)。此外,大多數經m7G修飾的tRNA的表達水平在亞致死熱處理后也有所提高,尤其是ThrTGT和LysCTT tRNA(圖4C)。翻譯預測進一步發現,亞致死熱應激后,關鍵EMT 基因SLUG和SNAIL的翻譯效率顯著增加,而敲除METTL1會減少熱處理HCC細胞中這兩個基因的mRNA翻譯(圖4D 和4E)。消耗METTL1會顯著降低SLUG 和SNAIL 的蛋白水平和mRNA 翻譯效率,這表明METTL1 促進熱處理HCC細胞中SLUG和SNAIL mRNA的翻譯(圖4F、4G)。此外,tRNA LysCTT在熱處理后顯著增加(圖4C)。這些數據表明,m7G tRNA,特別是tRNA LysCTT,以依賴于密碼子頻率的方式調節SLUG 和SNAIL的翻譯。因此,作者進行LysCTT挽救實驗,發現在缺失METTL1 的細胞中過表達LysCTT可在熱致死性應激后挽救SLUG 和SNAIL 的蛋白水平(圖4H),從而加強METTL1介導的tRNA m7G修飾與SLUG和SNAIL mRNA 翻譯之間的功能聯系。


    圖4. 亞致死熱應激以m7G tRNA密碼子頻率依賴的方式提高SLUG/SNAIL的翻譯效率


    5. SLUG/SNAIL異位表達挽救亞致死性熱應激下METTL1 敲低的 HCC 細胞的惡性能力
           在METTL1穩定敲除的HCC細胞中過表達SLUG/SNAIL進行挽救試驗(圖5A)。數據顯示,在亞致死性熱應激下,過表達SLUG或SNAIL能顯著促進METTL1敲除HCC細胞的生長和菌落形成(圖5B-5D)。此外,在過表達SLUG/SNAIL后,METTL1敲除的HCC細胞的遷移和侵襲能力得到恢復(圖5E-5H)。因此,SLUG/SNAIL是METTL1的重要下游靶標,在亞致死性熱應激下提高HCC細胞的惡性潛能。


    圖5. SLUG/SNAIL異位表達挽救亞致死性熱應激下METTL1敲低的HCC細胞的惡性能力


    6. METTL1 加速體內熱處理后HCC的轉移
           利用體內HCC轉移模型進一步研究METTL1在IRFA后HCC復發中的致癌功能。在脾內注射模型中,將經過熱處理的METTL1敲除的MHCC97H細胞和對照細胞注入NCG小鼠脾臟,以評估肝轉移情況(圖6A)。數據顯示,經熱處理的對照組細胞形成了更多的肝轉移瘤(7/7),而 METTL1 敲除組則顯著減少HCC腫瘤(分別為3/7和2/7)(圖 6B-6F)。此外,腫瘤組織中METTL1、WDR4、Ki-67、SLUG和SNAIL 的表達水平以及m7G tRNA的修飾水平在熱處理對照組中均有所上升,而在METTL1敲除組中則有所下降(圖6G-6M)。進一步用敲除METTL1的MHCC97H細胞建立尾靜脈注射模型(圖7A),以評估 METTL1在熱處理后調控肺轉移的功能。結果發現,正如預期的那樣,熱處理后對照細胞組出現更多的肺轉移(圖7B、7D和7E)。肺重量與體重的比值也顯示亞致死性熱應激誘導的肺轉移負擔更高(圖7C)。重要的是,消耗METTL1顯著抑制HCC 細胞的肺轉移和增殖活性,這一點從尾靜脈注射模型中腫瘤負荷的減少和Ki-67水平的降低可以看出(圖7F-7I)。因此,這些數據揭示METTL1 在熱處理后對體內轉移的促進具有重要作用。


    圖6. METTL1缺失在體內顯著抑制亞致死性熱應激下HCC細胞的肝內轉移


    圖7. METTL1缺失在體內顯著抑制亞致死性熱應激下HCC細胞的肺轉移


    7. METTL1在體內促進IRFA后的HCC轉移
           在原位異種移植HCC模型中進行IRFA。8周后對小鼠進行解剖以評估不同器官(包括肝臟和肺臟)的轉移情況(圖8A)。對所有組織進行HE染色定量后,發現shNC + IRFA 組(7/7)肝內轉移較多(圖8B、8C、8E 和8F)。值得注意的是,在shNC + IRFA 組發現了肝外轉移,包括肺、腹壁、脾、腎、膈、腸和腸系膜(圖8D、8G、8H)。正如預期的那樣,METTL1基因敲除顯著抑制IRFA 誘導的肝轉移和其他器官轉移,尤其是肺轉移的趨勢。這些數據證明METTL1在IRFA后促進HCC轉移的關鍵生理功能。


    圖8. METTL1在體內促進IRFA后的HCC轉移


    結論
           綜上所述,本研究提供了證據,證明在亞致死熱應激下,METTL1通過促進SLUG/SNAIL mRNA翻譯,以m7G tRNA修飾依賴的方式促進HCC轉移,為防止射頻熱消融治療后HCC轉移提供了分子基礎。

    實驗方法
    細胞培養,動物實驗,細胞活力和克隆形成檢測,細胞周期和細胞凋亡檢測,遷移和侵襲實驗,RNA提取和RT-qPCR,northern blot,northwestern blot,western blot,HE染色,免疫組化分析,多聚核糖體結合mRNA測序, m7G tRNA還原和斷裂測序(TRAC-seq),質粒構建和慢病毒轉導,體外亞致死熱處理模型構建,體內射頻消融不充分(IRFA)實驗,IRFA動物模型構建,轉移動物模型構建
    參考文獻
    Zhu S, Wu Y, Zhang X, Peng S, Xiao H, Chen S, Xu L, Su T, Kuang M. Targeting N7-methylguanosine tRNA modification blocks hepatocellular carcinoma metastasis after insufficient radiofrequency ablation. Mol Ther. 2023 Jun 7;31(6):1596-1614. doi: 10.1016/j.ymthe.2022.08.004. Epub 2022 Aug 13. PMID: 35965412; PMCID: PMC10278047.


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