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  • 可變剪接介導新circRNA生物發生揭示KRAS突變介導的胰腺癌淋巴轉移

    欄目:最新研究動態 發布時間:2023-11-06
    本文找到了一個新的circRNA,其在KRASG12DPDAC中上調,并且與KRASG12D?PDAC淋巴結(LN)轉移正相關......


           在約90%的胰腺導管癌癌(PDAC)患者中鑒定出KRAS突變,并且KRASG12D是PDAC中最常見的等位基因。靶向KRASG12D突變的基因療法在轉移性PDAC中實現了70%的消退,表明靶向KRASG12D在轉移性PDAC中的治療潛力。本文找到了一個新的circRNA,其在KRASG12DPDAC中上調,并且與KRASG12D PDAC淋巴結(LN)轉移正相關。在機制上,KRASG12D PDAC中的circARFGEF生物發生被選擇性剪接因子QKI-5顯著激活,促進了circARFGEF生物發生。并探討了circARFGEF海綿化miR-1205并促進JAK 2的活化,JAK2將STAT3磷酸化觸發KRASG12D PDAC淋巴管生成和LN轉移。本文于2023年6月,發表于《Cancer Research》上,IF=11.2。
















    1.circARFGEF在LN轉移的KRASG12DPDAC中高表達

           為了研究circRNA是否參與KRASG12D驅動的LN轉移,在3個配對的PDAC組織和9個正常的鄰近組織(NAT)(GSE234760)中進行了二代測序,發現了circARFGEF2在KRASG12D PDAC組織中最顯著上調,與具有其他KRAS亞型的PDAC組織相比(KRASG12C、KRASG12V、KRASWT)(圖1A和B)。此外,circARFGEF2 在LN陽性KRASG12D PDAC 患者或具有高度病理性腫瘤淋巴結轉移(TNM)階段的患者中過表達,并且與原發性腫瘤相比,轉移性LN具有更高的circARFGEF2 表達(圖1C和D)。原位雜交(ISH)和免疫熒光分析顯示,circARFGEF2過表達伴隨著KRASG12DPDAC組織中的微淋巴管密度(MLD)增加(圖1 E和F)。此外,熒光原位雜交(FISH)揭示了在LN陽性KRASG12D PDAC組織中的circARFGEF2富集,與LN陰性相比(圖1G和H),表明circARFGEF 2與KRASG12D PDAC的LN轉移正相關。Kaplan-Meier存活分析表明,在患有KRASG12D PDAC的患者中,circARFGEF2過表達與總存活(OS)和無病存活(DFS)呈負相關(圖1 I和J)。此外,在使用互補DNA(cDNA)而不是基因組DNA(gDNA)作為模板的PCR產物中檢測到circARFGEF 2(圖1 K)。與ARFGEF2 mRNA相比,circARFGEF2表現出對RNaseR的更強抗性,而Actinomycin D測定表明circARFGEF2具有比ARFGEF2 mRNA更長的半衰期(圖1 M和N)??傊?,這些發現證明circARFGEF2在KRASG12D PDAC患者中高表達且具有高度穩定的結構。


    圖1:circARFGEF2在LN轉移的KRASG12D PDAC患者


    2.QKI-5與circARFGEF2結合加速在circARFGEF2在LN轉移的KRASG12DPDAC中的生物合成
           用circRNA構建了6個雙色熒光報告子給予IRES介導的GFP翻譯,并將線性mRNA用mCherry標記以同時定量ARFGER2前體mRNA的線性和circRNA 剪接(圖2A)。在PANC-1細胞中應用KRASG12D抑制劑MRTX1133或KRASG12D siRNA后,由HA-mCherry表達指示的線性ARFGEF2增加,并且由FLAG-GFP表達指示的circARFGEF2形成以及GFP-mCherry比率顯著減少。而在Mia PaCa-2(KRASG12C)和BxPC-3(KRASWT)細胞中應用MRTX1133后未觀察到明顯變化(圖2B-D)。已經證明了QKI在circRNA生物發生中的關鍵作用。因此,在3對KRASG12D PDAC組織和NAT中進行二代測序以評估QKI是否調節KRASG 12D PDAC中的circARFGEF2生物發生,并確定QKI在KRASG12D PDAC組織中上調(GSE 234927)(圖2E)。雙色熒光報告基因測定顯示,下調QKI表達的顯著降低了GFP-mCherry比率(圖 2F和G),表明QKI是circARFGEF2生物發生所需的。雙色熒光報告測定和蛋白質印跡測定,并揭示降低QKI-5表達顯著降低FLAG-GFP表達,同時增加HA-mCherry表達(圖2H)。前體mRNA選擇性剪接通常由剪接體催化,剪接體的組裝與相關的蛋白輔因子相伴逐步發生。免疫共沉淀(Co-IP)測定,隨后質譜(MS)和蛋白質印跡鑒定出QKI-5與U2輔助因11(U2AF35)相互作用,直接觸發剪接體組裝以刺激剪接的U2AF亞基(圖2 I和J)。此外,降低U2AF35表達顯著阻礙QKI-5誘導的circARFGEF2生物發生(圖2K和L)。上述結果表明QKI-5募集U2AF35來調節ARFGEF2前體mRNA剪接,并促進circARFGEF2生物合成。為了證實ARFGEF2前mRNA上的精確QKI-5結合位點,我們用內含子3和6的截短序列進行了下拉測定,其揭示了QKI-5特別富集內含子31000-1200 nt和內含子67600-7800 nt(圖2 M和N)。內含子31128-1180 nt和內含子 67672-7740 nt的突變損害QKI-5和ARFGEF前mRNA結合,表明QKI-5 直接結合這兩個ARFGEF2前mRNA區域(圖2 O和P)。此外,我們評估了QKI-5和ARFGEF2前mRNA之間的相互作用是否影響PDAC中的circARFGE 2產生。CRISPR/Cas9介導的ARFGEF2前mRNA中內含子31128-1180 nt和內含子67672-7740 nt的敲除顯著降低了QKI-5介導的circARFGEF2過表達(圖2Q)??傊?,我們的結果證明QKI-5募集U2AF35并結合內含子31128-1180 nt和67672-7740 nt的轉錄水平,以促進circARFGEF 2剪接(圖2R)。


    圖2:QKI亞群結合至circARFGEF2剪接外顯子的側翼內含子,并加速KRASG12D PDAC中的circARFGEF2生物合成


    3.增加circARFGEF2生物合成促進KRASG12D PDACLN轉移
           circARFGEF2在KRASG12D PDAC細胞中下調抑制HLEC管形成和迀移能力,而circARFGEF2過表達促進KRASG12D PDAC細胞誘導的HLEC管形成和迀移(圖3A和B)。進一步評估QKI-5是否調節KRASG12D PDAC中的circARFGEF 2誘導的管形成和迀移,并且證明QKI-5過表達增強HLEC管形成和迀移能力,而下調circARFGEF2表達抑制QKI-5誘導的HLEC的淋巴管生成(圖3C)。QKI-5過表達顯著促進了KRASG12D PDAC細胞的LN轉移,而下調circARFGEF2的明顯逆轉了這種作用(圖3D)。原發性腫瘤的免疫組織化學(IHC)分析表明,降低circARFGEF2表達逆轉了由QKI-5上調誘導的MLD的增加(圖3E)。使用正電子發射斷層掃描-計算機斷層掃描18(PET-CT)掃描來評估裸鼠的原位致瘤性,發現QKI-5促進KRASG12D PDAC細胞的原位致瘤性,而當circARFGEF2下調時,這種作用受到阻礙(圖3F)。IHC結果顯示,QKI-5可顯著促進癌細胞向胰周淋巴結轉移,增加胰腺移植瘤模型中轉移淋巴結的數量,同時降低circARFGEF 2的表達可以逆轉這種效應(圖3G)。綜上所述,上述結果表明QKI-5介導的circARFGEF2促進體外KRASG12D PDAC淋巴管生成以及體內KRASG12D PDAC LN轉移。


    圖3:QKI-5介導的circARFGEF2促進體外KRASG12D PDAC淋巴管生成以及體內KRASG12D PDAC LN轉移


    4.circARFGEF2海綿化KRASG12D PDAC中的miR-1205

           研究circARFGEF2誘導KRASG12D PDAC LN轉移的機制。首先確定了circARFGEF2主要位于KRASG12D PDAC細胞的細胞質中(圖4A和4 B)。
           通過數據庫預測和驗證發現這些miRNA中,miR-1205最特異地在KRASG12D PDAC細胞系中過表達,而不是具有其他KRAS亞型的PDAC細胞系中過表達。RNA下拉測定揭示,與Oligo探針相比,在KRASG12D PDAC細胞而不是KRASWT PDAC細胞中,miR-1205被circARFGEF 2探針顯著富集(圖4C)。circARFGEF 2和miR-1205 序列的分析揭示了反向互補序列的存在(圖4D)。雙熒光素酶報告基因測定揭示miR-1205顯著降低circARFGEF2組的熒光素酶活性,而反向互補序列的突變削弱了這種作用(圖4 E),表明circARFGEF 2通過特異性序列海綿化miR-1205。此外,FISH測定證明circARFGEF2和miR-1205共定位在KRASG 12D PDAC細胞的細胞質中(圖4F),表明 circARFGEF2和miR-1205之間的相互作用。體外實驗表明,過表達circARFGEF2的觸發HLEC管形成和迀移,而過表達miR-1205的明顯逆轉了這種作用(圖4G)。綜上所述,結果表明circARFGEF2在KRASG12D PDAC細胞中充當miR-1205海綿。
           KEGG通路分析揭示JAK-STAT途徑是與circARFGEF2相關的最顯著富集的通路(圖4H)。JAK代表用于激活JAK-STAT途徑的核心組分,并且由JAK 1、JAK 2、JAK 3和TYK 2組成。隨后,檢測了JAK亞型的表達譜,發現JAK 2與KRASG12D PDAC細胞中circARFGEF 2的表達正相關(圖4I)。此外,miR-1205與KRASG12D PDAC細胞中的JAK2表達負相關(圖4J和K)。雙熒光素酶報告基因測定表明,miR-1205明顯降低JAK2 3′UTR熒光素酶構建體中的熒光素酶活性,而不是miR-1205結合位點中的突變序列(圖4L)。miR-1205過表達明顯抑制circARFGEF2誘導的JAK2表達,這表明 circARFGEF2充當miR-1205海綿以增加JAK2表達(圖4 M和N)。WB顯示circARFGEF2過表達促進JAK2表達和STAT 3磷酸化(圖4O),而circARFGEF2下調降低JAK2表達并抑制STAT 3磷酸化(圖4P)。


    圖4:circARFGEF2海綿化KRASG12D PDAC中的miR-1205并激活KRASG12D PDAC中的JAK2-STAT3信號通路


    5.JAK2-STAT3通路阻斷抑制circARFGEF 2誘導的KPC小鼠LN轉移

           circARFGEF2過表達顯著促進HLEC管形成和迀移能力,而JAK2-STAT3通路抑制劑WP1066顯著逆轉該作用(圖5A和B)。此外,體內實驗證明,與對照裸小鼠相比,circARFGEF2過表達裸小鼠具有更大的膝彎淋巴結轉移瘤,并且WP1066顯著阻礙circARFGEF2誘導的LN轉移(圖5C和D)。IHC分析顯示,circARFGEF2過表達促進膝彎LN的轉移,增加足墊腫瘤中的MLD,而抑制JAK 2-STAT3通路逆轉了這些作用(圖5E和F)。這些結果表明,circARFGEF2 通過JAK2-STAT3通路促進KRASG12D PDAC中的淋巴管生成和LN轉移。為了更好地理解circARFGEF2在體內KRASG12D PDAC LN轉移中的作用,使用工程化的轉基因KrasG12D/+ Trp 53 R172 H/+Pdx-1-Cre(KPC)小鼠模型。結果表明circARFGEF2過表達顯著增加了原發性PDAC腫瘤體積,并且抑制JAK2-STAT3信號通路則逆轉了這種作用(圖6A和B)。此外, circARFGEF2過表達顯著增加了KPC小鼠中轉移性腹部LN的數量和原發性PDAC腫瘤中的MLD,而阻斷 JAK 2-STAT 3信號傳導途徑阻礙了這些作用(圖6C和D)。這些結果表明,阻斷JAK2-STAT3通路對CircARFGEF2誘導的KRASG12D PDAC的淋巴管生成和LN轉移表現出抑制作用。



    圖5:JAK2-STAT3通路阻斷抑制circARFGEF 2誘導的KPC小鼠LN轉移


    6.KRASG12D PDAC患者中QKI-5-circARFGEF 2-JAK 2軸的臨床相關性

           評估 QKI-5介導的circARFGEF2-miR-1205-JAK2軸在患有KRASG12D PDAC的患者中的臨床意義。結果表明,與NAT相比,miR-1205在KRASG 12D PDAC組織中下調,并且circARFGEF2、QKI-5、JAK2在KRASG12D PDAC組織中上調(圖6 E和F)。此外,miR-1205與LN轉移負相關,而circARFGEF 2、QKI-5和JAK2在LN轉移性KRASG12D PDAC組織中顯著上調(圖6 G和H)。IHC分析顯示,QKI-5和JAK2與KRASG12D PDAC組織中的circARFGEF2表達正相關(圖6 I-K)。相關性分析揭示JAK2與miR-1205表達負相關,而與QKI-5表達正相關,并且在circARFGEF2和miR-1205表達之間觀察到負相關(圖6L和M)??傊?,這些研究結果表明,來源于QKI-5依賴性剪接的circARFGEF2海綿化miR-1205并激活JAK2-STAT3信號傳導通路以誘導KRASG12D PDAC LN轉移。


    圖6:KRASG12D PDAC患者中QKI-5-circARFGEF 2-JAK 2軸的臨床相關性


    結論
           總之,本文提出了KRASG12D突變驅動的 circARFGEF2生物合成的新機制,其經由QKI-5依賴性剪接介導miR-1205-JAK2-STAT3軸以觸發PDAC LN轉移。抑制circARFGEF2表達或JAK2-STAT3通路顯著阻礙了KPC模型中的腫瘤生長。這些發現使得能夠對PDAC LN轉移中的調節機制有新的理解,表明circARFGEF2是KRASG12D PDAC中的潛在治療靶標。

    實驗方法
    臨床樣本收集,RNA測序和數據分析,免疫組化,膝彎淋巴結轉移模型,體外移植瘤模型, KrasG12D/+Trp53R172H/+Pdx-1-Cre (KPC)小鼠注射AVV載體,質粒和siRNA轉染,CRISPR/Cas9介導的基因敲除,熒光原位雜交實驗,瓊脂糖凝膠電泳,RNase R消化和Actinomycin D處理實驗,RNA下拉實驗,Transwell,管形成實驗,5-EDU實驗,雙熒光素酶實驗,WB,RT-qPCR,亞細胞分離試驗。
    參考文獻
    Kong, Y., Luo, Y., Zheng, S., Yang, J., Zhang, D., Zhao, Y., Zheng, H., An, M., Lin, Y., Ai, L., Diao, X., Lin, Q., Chen, C., & Chen, R. (2023). Mutant KRAS mediates circARFGEF2 biogenesis to promote lymphatic metastasis of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer research, CAN-22-3997. Advance online publication. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-22-3997


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