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  • 7張圖揭示泛素化在癌癥中突變型p53積累和功能性獲得中的新角色

    欄目:最新研究動態 發布時間:2023-10-23
    本研究通過CO-IP和LC-MS/MS實驗確定了TRIM21直接靶向結合mutp53,且TRIM21能夠通過影響mutp53的泛素化負性調控mutp53的表達......



           突變型p53(mutp53)蛋白通常在人類癌癥中積累到非常高的水平,以通過功能獲得(GOF)機制促進癌癥進展。目前,mutp53積累和GOF的潛在機制尚未完全了解。TRIM21作為mutp53的一個關鍵的E3泛素連接酶,mutp53通過篩選特定的mutp53相互作用的蛋白質。本研究通過CO-IP和LC-MS/MS實驗確定了TRIM21直接靶向結合mutp53,且TRIM21能夠通過影響mutp53的泛素化負性調控mutp53的表達,抑制癌細胞的錨定非依賴性生長,并且能夠抑制原位和皮下瘤的生長,TRIM21的低表達了也逆轉了mutp3介導的癌癥的不良預后。本文章于2023年3月發表在《Journal Clinical Investigation》上,IF=15.9



    技術路線

















    主要研究內容

    1.TRIM21是mutp53相互作用的蛋白

           在表達異位熱點R175H mutp53或wtp 53的人結直腸癌p53?/? RKO細胞中使用co-IP與p53抗體篩選特異性mutp53相互作用蛋白,然后進行LC-MS/MS分析。TRIM21被鑒定為優先結合R175H mutp53但不結合wtp 53的潛在蛋白質。R175H、G245S、R248Q和R273H熱點mutp53已顯示出GOF活性并廣泛用于mutp 53 GOF研究。因此,在表達異位TRIM21-Flag和mutp53的p53-/-RKO細胞中,使用co-IP,隨后進行Western印跡分析,研究了TRIM21和這四個熱點GOF mutp53之間的相互作用(圖1A)。在p53+/+ RKO細胞中沒有觀察到內源性TRIM21和wtp53之間的明顯相互作用(圖1B),但觀察到內源性TRIM21和不同mutp53之間的相互作用(圖1C和D)。為了確定TRIM21-mutp53相互作用所需的TRIM21結構域,構建表達TRIM21-Flag系列缺失突變體的載體(圖1 E),并與R175H mutp53載體共轉染到p53-/-RKO細胞中用于共IP測定。結果顯示SPRY和PRY結構域是TRIM21與R175H mutp53相互作用的重要位點(圖1 E)。同時,R175H mutp53的DBD結構域是R175H mutp53與TRIM21相互作用的位點(圖1F)。使用重組GST-TRIM21和His-mutp53或His-wtp53蛋白的體外谷胱甘肽S-轉移酶(GST)下拉實驗顯示,TRIM21在體外直接與mutp53相互作用,但不與wtp53相互作用(圖1H)。此外,SPRY和PRY結構域的缺失消除了GST-TRIM21在體外與His-mutp53直接相互作用的能力(圖1H)??傊?,這些結果表明TRIM21直接且特異性地與細胞中的mutp53相互作用。



    圖1:TRIM21是一種特定的mutp53結合蛋白


    2.TRIM21抑制了mutp53在癌癥細胞中的積累

           通過對TRIM 21穩定敲低檢測癌細胞中的mutp53蛋白水平,發現TRIM 21-Flag的異位表達顯著下調SK-BR3、HT29、LS1034和HCC70細胞中不同內源mutp53蛋白的水平,而wtp53蛋白的表達水平并無明顯改變(圖2A)。此外,TRIM21-KO分別明顯增加SK-BR3和HT29細胞中R175H和R273H mutp53的蛋白質水平(圖2B)。類似地,通過不同shRNA載體的TRIM21敲低分別明顯增加了LS1034和HCC70細胞中的G245S和R248Q mutp53蛋白水平,但對MCF 7和p53+/+ RKO細胞中的wtp53蛋白水平影響較?。▓D2C)。通過將R172H mutp53敲入小鼠,提取源自TRIM21+/+ p53R172H/R172H和TRIM21-/-p53R172H/R172H小鼠的小鼠胚胎成纖維細胞(MEF),發現TRIM21-/-p53R172H/R172H MEF顯示出比TRIM21+/+ p53R172H/R172H MEF高得多的mutp53蛋白水平(圖2D)。然而,在TRIM21+/+ p53+/+和TRIM 21-/- p53+/+ MEF之間沒有觀察到wtp53蛋白水平的明顯差異(圖2D)。RT-qPCR測定的結果顯示,TRIM21沒有明顯影響上述細胞系中mutp53或wtp53的mRNA水平(圖2E-H)。這些結果表明,TRIM21優先下調mutp53而不是wtp53的蛋白水平,并且TRIM21缺陷導致mutp53在癌細胞中積累。



    圖2:TRIM21抑制了mutp53在癌癥細胞中的表達


    3.TRIM21促進mutp53的泛素化和降解

           用表達R175H或R273H mutp53的載體連同表達WT TRIM21-Flag或缺失RING結構域(ΔRING)的突變TRIM21-Flag的載體共轉染p53-/-RKO細胞。發現WT而非ΔRING TRIM21-Flag明顯下調p53?/? RKO細胞中的外源mutp53蛋白水平,而用蛋白酶體抑制劑MG132處理細胞后這種變化又被消除(圖3A和B)。為了研究TRIM21是否泛素化mutp53,在不同細胞中進行體內泛素化測定。WT而非ΔRING TRIM21-Flag的異位表達顯著促進了p53?/? RKO細胞中外源R175H和R273H mutp53的泛素化(圖3C)。此外,TRIM21 KO分別降低SK-BR3和HT29細胞中內源性R175H和R273H mutp53的泛素化(圖3D)。TRIM 21介導的mutp53泛素化通過使用重組蛋白的體外泛素化測定進一步證實; WT GST-TRIM 21誘導His-mutp53的泛素化,但不誘導Hiswtp53的泛素化,其通過TRIM21 RING結構域的缺失而消除(圖3E)。驗證TRIM21是否使mutp53不穩定,在內源性R175H mutp53蛋白水平的蛋白質印跡分析之前,用蛋白質合成抑制劑環己酰胺(CHX)處理具有TRIM 21-Flag表達或TRIM21 KO的SK-BR3細胞及其對照細胞不同的時間段。R175H mutp53蛋白的半衰期通過TRIM21-Flag的異位表達而明顯降低(圖3F),并且通過TRIM21 KO而增加(圖3G)。這些結果表明TRIM21直接結合mutp53以泛素化和降解mutp53,并且TRIM21缺陷導致mutp53穩定和積累。



    圖3:TRIM21通過泛素化促進mutp53蛋白的降解


    4.TRIM21抑制mutp53積累以抑制癌細胞的錨定非依賴性生長

           驗證TRIM21是否影響mutp53 GOF活性,促進錨定非依賴性細胞生長。發現癌細胞中mutp53的敲低顯著抑制了錨定非依賴性細胞生長,mutp53在癌細胞中的GOF活性(圖4A和B)。癌細胞中的TRIM21 KO顯著促進非貼壁依賴性細胞生長,但這種效應在很大程度上被mutp53 KO消除(圖4A和B)。異位TRIM 21-Flag表達顯著抑制細胞的貼壁非依賴性生長,但對其相應的mutp53 KO細胞中抑制作用減弱(圖4C)。轉化的MEFs的錨定非依賴性生長被wtp53顯著抑制(p53 +/+ vs p53-/-),但被R172H mutp53促進(p53R172H/R172H vs p53-/-)。另外,TRIM21缺失顯著促進p53R172H/R172H MEFs的錨定非依賴性生長,但不促進p53 +/+p53?/? MEFs的錨定非依賴性生長(圖4D)。這些結果共同表明,TRIM21通過抑制mutp53積累和GOF來抑制貼壁非依賴性細胞生長。



    圖4:TRIM21抑制mutp53 GOF,促進癌細胞的非錨定生長


    5.TRIM21抑制mutp53積累以抑制原位和皮下腫瘤的生長

           通過SKBR3細胞構建的原位乳腺腫瘤和在無胸腺裸鼠中皮下注射HT29細胞形成的結腸直腸異種移植腫瘤,SK-BR3細胞中的TRIM21 KO顯著促進SK-BR3原位腫瘤的生長,而R175H mutp53 KO顯著抑制腫瘤生長并在很大程度上消除了TRIM21 KO對腫瘤生長的促進作用(圖5A)。SK-BR3腫瘤組織的蛋白質印跡分析和IHC染色顯示TRIM21 KO明顯增強mutp53蛋白水平(圖5B和C)。同樣,HT29細胞中的TRIM21 KO顯著促進腫瘤生長并明顯增加腫瘤中mutp53蛋白水平,但HT29細胞中的mutp53 KO顯著抑制腫瘤生長并在很大程度上消除了TRIM21 KO對腫瘤生長的促進作用(圖5D和E)。另外,TRIM21-Flag表達大大降低了SK-BR3和HT29腫瘤中的mutp53水平(圖5G和I)。這些結果共同證明了TRIM21抑制mutp53積累以抑制mutp53 G0F促進腫瘤生長。



    圖5:TRIM21抑制mutp53積累促進腫瘤生長


    6.TRIM21的低表達校正mutp53癌癥中的不良預后

           組織芯片的結果顯示,TRIM21的表達在兩個不同的結腸直腸癌組中,分別有63%(n=57/90)和44%(n=22/50)的結腸直腸癌下調(圖6A),在50%(n=20/40)的乳腺癌中下調(圖6 B)。此外,與其匹配的相鄰非腫瘤組織相比,結直腸癌和乳腺癌中TRIM21的平均蛋白水平顯著降低(圖6A和B)。同樣,與非腫瘤乳腺組織相比,TRIM21蛋白水平在這些乳腺癌中顯著下調(圖6C)。TCGA數據庫中的TRIM21表達的分析顯示,幾種類型的腫瘤中的低TRIM21表達與患有mutp53癌癥而非wtp53癌癥的患者中的不良臨床結果顯著相關(圖6D)。這些結果表明TRIM21在一些攜帶mutp53的癌癥中的腫瘤抑制功能。



    圖6:TRIM21的低表達校正mutp53癌癥中的不良預后

    7.TRIM21缺失導致mutp53在正常組織中積累并促進p53R172H/R172H小鼠的腫瘤發生

           構建TRIM21+/+ p53R172H/R172H和TRIM21-/-p53R172H/R172H小鼠,發現TRIM21缺失沒有明顯影響p53-/-p53+/+小鼠的壽命,但TRIM21缺失導致腫瘤發病更早,這顯著降低了p53R172H/R172H小鼠的壽命。TRIM21+/+ p53R172H/R172H和TRIM21-/-p53 R172H/R172H小鼠的中位生存期分別為157天和134天(p=0.0002;圖7A)。在p53 R172 H/R172H小鼠的正常組織(包括脾、胸腺、小腸和結腸組織)中未觀察到mutp53蓄積,通過Western印跡和IHC分析,在TRIM21-/-p53R172H/R172H小鼠的這些正常組織中mutp53蛋白蓄積至高水平(圖7B和C)。而在正常(非應激)條件下,wtp53蛋白水平在正常組織中保持在非常低的水平(圖7D)。盡管mutp53在TRIM21+/+ p53R172H/R172H和TRIM21-/-p53R172H/R172H小鼠的腫瘤中積累,但與TRIM 21+/+ p53R172H/R172H腫瘤相比,在TRIM21-/-p53R172H/R172H腫瘤中觀察到更高水平的mutp53積累(圖7 E)。通過co-IP測定證實了腫瘤中TRIM21和R172H mutp53蛋白之間的相互作用,表明TRIM21與mutp53在體內相互作用(圖7 F)??傊?,這些結果表明TRIM 21缺失導致mutp53在正常組織中積累,并且mutp53在腫瘤中進一步積累,導致p53R172H/R172H小鼠的更早的腫瘤發作和壽命縮短。



    圖7:TRIM21缺失導致mutp53積累并促進p53R172H/R172H小鼠的腫瘤發生


    結論
           總之,這個研究揭示了癌癥中mutp53積累和GOF的關鍵機制,并且還鑒定了TRIM21在癌癥中的腫瘤抑制功能的重要機制。更好地理解腫瘤中mutp53積累和GOF的機制將為開發針對攜帶mutp53的癌癥的有效治療策略提供新的機會。

    實驗方法
    細胞培養和載體構建,CRISPR/Cas9構建 KO細胞系,LC-MS/MS測定,western blot,免疫共沉淀實驗,GST pull-down,RT-qPCR,泛素化測定,半衰期分析,錨定非依賴性生長測定,小鼠成瘤實驗,免疫組化,TCGA數據庫分析。
    參考文獻
    Liu, J., Zhang, C., Xu, D., Zhang, T., Chang, C. Y., Wang, J., Liu, J., Zhang, L., Haffty, B. G., Zong, W. X., Hu, W., & Feng, Z. (2023). The ubiquitin ligase TRIM21 regulates mutant p53 accumulation and gain of function in cancer. The Journal of clinical investigation, 133(6), e164354. https://doi.org/10.1172/JCI164354


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