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  • 國自然熱點之一tsRNA——5′-tiRNA-Gln控制肝細胞癌發展

    欄目:最新研究動態 發布時間:2023-10-17
    研究發現5′-tiRNA-Gln通過結合真核啟動因子4A-I(EIF4A1)發揮其功能,導致翻譯受到部分抑制,控制HCC的發展......



           tRNA衍生的小RNA(tsRNA)是新型的非編碼RNA,參與各種疾病的發生和發展。然而,它們在肝細胞癌(HCC)中的確切存在和功能仍不清楚。本研究中,對HCC中差異表達的tsRNA進行分析。發現一種新的tsRNA,tRNA Gln-TTG衍生的5′-tiRNA-Gln明顯下調,其表達水平與患者的病情發展相關聯。5′-tiRNA-Gln通過結合真核啟動因子4A-I(EIF4A1)發揮其功能,導致翻譯受到部分抑制,控制HCC的發展。該研究于2023年3月發表在《Frontiers of Medicine》,IF:8.1。 
    技術路線


    主要研究結果
    1. HCC和正常組織中tsRNA特征普分析
           為了確定特定的tsRNA在原發性HCC中的表達,作者通過RNA-PAGE分析4對腫瘤和鄰近的非腫瘤肝組織tiRNA的水平。HCC組織的總tiRNA低于鄰近組織(圖1A)。通過高通量測序對這些樣本的小RNA轉錄組進行分析。結果顯示,無論在腫瘤還是鄰近的非腫瘤組織中,reads數都在20-24 nt和31-33 nt富集(圖1B)。miRNA占總reads數的絕大部分,其次是tsRNA和前體tRNA(圖1C)。腫瘤組織中有77個tsRNA,非腫瘤組織中有67個tsRNA,共有tsRNA 有208個(圖1D)。無論是在腫瘤還是鄰近的非腫瘤組織中,5-tRF所占比例最高,其次是3-tRF和5′-tiRNA(圖1E和1F)。


    圖1. HCC組織中的小ncRNA概況


    2. 5′-tiRNA-Gln在腫瘤組織中下調,負向調節HCC轉移和腫瘤大小
           對差異表達的tsRNA進行分析,總共發現80個上調的和74個下調的tsRNA(圖2A)。其中包括19個tiRNA(圖2B),只有5′-tiRNA-Gln的表達與數據庫中一致。通過RT-qPCR在76個HCC組織對中驗證了5′-tiRNA-Gln的表達水平。結果顯示,與差異分析結果一致,5′-tiRNA-Gln在腫瘤組織中明顯下調,表明具有腫瘤抑制作用(圖2C)。Northern blot實驗也得到了類似的結果(圖2D)。作者還發現,轉移組的5′-tiRNA- Gln的相對平均水平明顯低于非轉移組(圖2E)。且5′-tiRNA-Gln表達水平的降低與大腫瘤呈正相關(圖2F)。這些結果表明,5′-tiRNA-Gln在HCC中明顯下調,在HCC轉移和腫瘤大小中起著負向調節作用。


    圖2. 5′-tiRNA -Gln在HCC組織中下調并與HCC進展有關


    3. 過表達5′-tiRNA-Gln抑制HCC細胞增殖、遷移和侵襲
           5′-tiRNA-Gln mimics轉染24小時后,分析它對HCC細胞生長、遷移和侵襲的影響。CCK-8實驗顯示,5′-tiRNA-Gln mimics降低細胞的活力(圖3A)。Transwell實驗顯示,5′-tiRNA-Gln mimics的過表達降低了Huh-7細胞的遷移和侵襲能力(圖3B)。siRNA進行功能缺失實驗,之后對細胞活力、遷移和侵襲進行研究(圖3C和3D),結果表明,5′-tiRNA-Gln的敲除增強SK-Hep-1細胞的生存能力、遷移和侵襲。將穩定轉染5′-tiRNA-Gln或對照RNA的Huh-7細胞皮下注射到裸鼠體內,6周后,與對照組相比,5′-tiRNA-Gln腫瘤重量更少(圖3E)。菌落形成實驗也得到類似的結果(圖3F)。這些結果表明,過表達5′-tiRNA-Gln抑制HCC細胞的活力。


    圖3. 5′-tiRNA-Gln可抑制HCC細胞在體外和體內的增殖、遷移和侵襲。


    4. 5′-tiRNA-Gln與EIF4A1選擇性互作
           將生物素標記的5′-tiRNA-Gln轉染到Huh-7細胞中48小時,MS鑒定出84個特異性結合的蛋白質。根據蛋白質的得分,EIF4A1被選為候選人(圖4A),它是翻譯啟動過程中的一個關鍵酶。根據GEPIA生存曲線分析,HCC中較高的EIF4A1表達水平意味著較低的生存率(圖4B),表明其具有腫瘤蛋白作用。RNA pull-down實驗證明,EIF4A1與5′-tiRNA- Gln有更強的結合力(圖4C)。RIP實驗證實,5′-tiRNA-Gln在EIF4A1免疫沉淀物中明顯富集(圖4D)。RNA FISH和免疫熒光檢測顯示,5′-tiRNA-Gln和EIF4A1在細胞質中發生共定位(圖4E)。因此,作者推斷5′-tiRNA-Gln通過與細胞質中的EIF4A1相互作用來抑制HCC腫瘤發展。


    圖4. 5′-tiRNA-Gln與EIF4A1選擇性互作


    5. 5′-tiRNA-Gln過表達抑制翻譯
           通過嘌呤霉素捕獲,確定新生蛋白合成水平(圖5A),驗證5′-tiRNA-Gln對EIF4A1功能的影響。結果顯示,5′-tiRNA-Gln抑制蛋白質的合成率。COG/KOG功能分類分析表明,下調的蛋白主要與轉錄和翻譯、核糖體結構和生物生成過程有關(圖5C)。對下調蛋白的KEGG分析顯示,乙型肝炎、MAPK信號傳導、丙型肝炎和癌癥的途徑發生顯著變化(圖5D)。Western blot表明,通過過表達5′-tiRNA-Gln和下游的磷酸化蛋白(p-ERK1/2和p- STAT3),ARAF、MEK1/2和STAT3的表達被下調。然而,在BID的表達中沒有觀察到明顯的差異(圖5E)。這些結果表明,5′-tiRNA-Gln的過量表達直接針對EIF4A1的功能,而不是其表達水平,從而抑制了EIF4A1相關翻譯。


    圖5. 5′-tiRNA-Gln在Huh-7細胞中抑制翻譯


    6. G-四鏈體結構是5′-tiRNA-Gln的必要條件
           根據QGRS Mapper構建了沒有能力形成G-四聯體的突變體5′-tiRNA-Gln。通過過表達突變體5′-tiRNA-Gln,研究了Huh-7細胞的活力、遷移和侵襲能力(圖6A和6B)。突變體與5′-tiRNA-Gln有明顯差異。RNA pull-down實驗表明突變體5′-tiRNA-Gln未能特異性地下拉EIF4A1(圖6C)。接下來測定了多聚核糖體的情況,結果顯示,與突變體相比,5′-tiRNA-Gln減少了mRNA與多聚核糖體的結合(圖6D)。進一步, 檢測了ARAF、MEK1/2和STAT3的表達。ARAF、MEK1/2和STAT3的mRNA沒有明顯差異(圖6E),而與突變體相比,過表達5′-tiRNA-Gln明顯降低了它們與EIF4A1的mRNA(圖6F)和蛋白質結合水平(圖6G)。這些結果表明,5′-tiRNA-Gln形成G-四鏈體的潛力,是其調節EIF4A1介導的翻譯和抑制HCC進展的必要條件。


    圖6. 突變的5′-tiRNA-Gln失去了抑制Huh-7細胞活力的功能


    7. HCC腫瘤中5′-tiRNA-Gln的表達水平與ARAF、MEK1/2或STAT3的免疫表達負相關
           IHC染色和Spearman相關性分析顯示,HCC組織中5′-tiRNA-Gln和ARAF、MEK1/2或STAT3的表達水平有明顯的負相關(圖7A)。圖7B為5′-tiRNA-Gln在HCC進展中的作用示意圖。


    圖7. HCC組織中5′-tiRNA-Gln與ARAF、MEK1/2和STAT3的表達呈負相關


    結論
           綜上所述,該研究分析了HCC中差異表達的tsRNA,并發現了一種新的tiRNA,即5′-tiRNA-Gln,它是一種腫瘤抑制因子。5′-tiRNA-Gln與EIF4A1相互作用,通過分子內G-四鏈體結構負向調節相關蛋白的翻譯,抑制了HCC細胞的增殖、遷移和侵襲。

    實驗方法
    RNA-PAGE,RT-qPCR,Northern blot,siRNA干擾,Transwell,裸鼠成瘤,菌落實驗,RNA pull-down,RIP,RNA FISH,Western blot,多聚核糖體分析,質譜分析,IHC染色
    參考文獻
    Wu C, Liu D, Zhang L, Wang J, Ding Y, Sun Z, Wang W. 5'-tiRNA-Gln inhibits hepatocellular carcinoma progression by repressing translation through the interaction with eukaryotic initiation factor 4A-I. Front Med. 2023 Mar 28. doi: 10.1007/s11684-022-0966-6. Epub ahead of print. PMID: 36973570.


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