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  • 多組學生信揭示結直腸癌肝轉移的細胞間互作空間網絡

    欄目:最新研究動態 發布時間:2023-06-07
    本文主要研究轉移性結直腸癌(mCRC)肝腫瘤微環境(TME)的細胞變化特征。作者證明了肝臟中mCRC的特征是TME中......


    肝臟是癌癥最常見的轉移部位。肝臟微環境被改造,以提供有利于結腸癌細胞生長的生態位,但這種改造的細胞轉變仍不清楚。本文主要研究轉移性結直腸癌(mCRC)肝腫瘤微環境(TME)的細胞變化特征。作者證明了肝臟中mCRC的特征是TME中巨噬細胞的轉錄改變;巨噬細胞和成纖維細胞之間的細胞間網絡支持CRC在肝臟免疫抑制轉移生態位中的生長。這些特征可用于靶向免疫檢查點抵抗的MSS腫瘤。本文于202210月發表在《Clinical Cancer Research》。

     

    技術路線:



    主要實驗結果:

    1、CRC肝轉移細胞TME的組分特征

    如圖1A所示,本研究依賴于三種不同的方法來表征結直腸癌轉移性TME,包括單細胞測序分析,多維免疫熒光(IF)和反卷積細胞狀態驗證。單細胞測序結果的降維UMAP揭示大多數細胞簇都有來自不同樣本的貢獻(圖1B),表明在聚類過程中沒有明顯的批次效應。根據所建立的特定細胞類型的標記基因的表達,將細胞類型進行注釋聚類(圖1C-D)。根據組織樣本的大小,單細胞測序檢測的細胞的絕對數量、類型和比例各不相同(圖1E)。

    此外,作者分析了轉移性腫瘤上皮細胞的基因表達特征,以及腫瘤上皮細胞中非整倍體與染色體失衡特征,結果在附圖中。


    1CRC肝轉移細胞TME的組分特征

     

    2、mCRC、正常肝臟和PBMC中的髓細胞譜系

    作者在二次聚類分析后檢查了不同樣本中的髓細胞群(圖2A2B)。髓細胞群具有與組織來源相關的簇。匹配的肝組織具有正常的髓細胞,存在于多個不同的簇中。匹配的外周血具有正常的單核細胞,這些單核細胞與其他巨噬細胞類型分開聚集,沒有重疊。來自mCRC樣品的巨噬細胞與匹配的正常肝組織巨噬細胞和外周單核細胞分開聚集。具體而言,mCRC巨噬細胞存在于簇1和簇3中(圖2A2B)。

    隨后,作者確定了哪些基因定義了特定的髓細胞簇。發現CD14FCGR3ACD16)陽性的PBMC單核細胞高度表達S100A家族基因(圖2C)。樹突狀細胞表達HLA基因、CD1C、CLEC9AIDO1等。肝內巨噬細胞包括正常庫普弗細胞表達CD5L、MARCO、LIPA、MAF、VCAM1等。還發現SPP1高表達的腫瘤相關巨噬(TAM)細胞群,這些巨噬細胞存在于簇1和簇3(圖2C)。

    作者比較了轉移性TME巨噬細胞與正常肝組織中存在的其他巨噬細胞的基因表達特征(圖2D)。SPP1+TAMAPOC1、APOE、TREM2、FN1、LGALS3、FTL、CD9、CTSB等表達水平升高。

    作者應用不同的表達分析方法來確認這些重編程TME巨噬細胞的功能狀態。使用enrichR程序,對TME巨噬細胞中差異表達的基因進行了通路分析,以確定它們調節的生物學相關過程。結果檢測到與ECM組織和代謝相關的term顯著富集。不同的代謝途徑也被富集,包括糖脂代謝、葡萄糖代謝和高密度脂蛋白介導的脂質轉運(圖2E)。接下來,量化了泡沫巨噬細胞和肝硬化疤痕相關巨噬細胞的表達特征。與正常肝巨噬細胞相比,mCRC巨噬細胞對這兩種基因特征都有顯著富集(圖2F)。這些結果與差異基因表達分析的結果重疊。

     

    2mCRC、正常肝臟和PBMC中的髓細胞譜系

     

    3、肝臟轉移微環境中的基質細胞成分

    使用重聚類和批量校正來表征肝臟mCRC微環境中存在的不同基質細胞。聚類分析顯示,來自mCRC的基質細胞與正常肝臟中的基質細胞分離(圖3A)。在不同的簇中,有三種主要的細胞類型,包括成纖維細胞、內皮細胞和肝星狀細胞(HSC;圖3B)。與mCRC相關的成纖維細胞存在于簇1和簇4中(圖3B和3C)。簇1僅包含來自mCRC的成纖維細胞,并且與正常肝組織的成纖維纖維細胞明顯分離。這些細胞的特征是ECM相關基因,如參與膠原合成相關基因的表達升高,POSTN、FN1、MGP等(圖3D)。因此,聚類1具有CAF的屬性。

    將一組CAF差異表達基因與“matrisome(基質組)”的成分進行了比較,“基質組”是指ECM的核心成分?;|組包括纖維連接蛋白、膠原、層粘連蛋白、蛋白多糖等,它們與ECM結構及其分泌有關(圖3E)。CAFs具有基于幾種膠原基因(COL1A1、COL3A1、COL5A1等)、各種ECM糖蛋白(FN1、POSTN、SPARC、THBS1等)和蛋白聚糖(BGN、VCAN等)的差異表達的基質組程序。這些CAFs細胞還高度表達ECM調節基因,包括MMP11、MMP14、TIMP1、LOXL1和LOXL2,這些基因參與ECM重塑。這些結果表明轉移性TME中的成纖維細胞具有促進腫瘤的ECM表達特征。


    3肝臟轉移微環境中的基質細胞成分


    4、巨噬細胞和CAFs的互作網絡影響其細胞狀態

    作者提供的部分附圖的結果顯示,對于所有mCRC,來自CD8 T細胞的結果和Tregs的存在表明免疫抑制的TME缺乏抗腫瘤活性。并且,CAFsTME中最多產的信息溝通者,在所有細胞間相互作用中占前10%,此外,TME成纖維細胞和巨噬細胞影響mCRC中的T細胞。

    作者發現巨噬細胞和CAFs通過特定的受體-配體相互作用影響彼此的基因表達程序。首先,從TME中的細胞中鑒定了配體,這些配體可以導致mCRC CAFs中基質組基因的表達(圖4A)。排名最高的基因之一是已建立的ECM調節基因TGFB1,它來源于NK細胞,驗證了這種方法。一些配體來源于巨噬細胞,包括SPP1、IL1B、TNF、MMP9CCL2。這些配體具有調節包括膠原家族在內的幾個核心基質組基因的靶基因表達的潛力。巨噬細胞配體的其他CAF基質組靶基因包括MMP2VEGFA。這一結果進一步支持了上述發現,即重編程的SPP1+巨噬細胞狀態促進mCRC TME中的纖維化。此外,CAFs自身表達了幾種配體,表明存在自分泌信號。這些配體包括AGT、TGFB3、CTGF、CCL2、FGF1、HGF、CXCL12CSF1。

    接下來,檢測哪些配體可以導致重編程巨噬細胞狀態,其特征為炎癥纖維化和脂質代謝。排名靠前的配體包括FGF1、CSF1、PGF、TGFB3TIMP1;均來源于CAFs(圖4B)。這些配體可以靶向巨噬細胞并調節SPP1、FN1APOE的表達。因此,來自CAFs的配體具有通過配體-受體相互作用重新編程mCRC巨噬細胞的潛力??偟膩碚f,這些結果表明TME巨噬細胞和CAFs之間存在信號網絡。這種細胞間通訊影響兩種細胞類型的轉錄表型。

     

    4巨噬細胞和CAFs的互作網絡影響其細胞狀態

     

    5、肝臟中mCRC TME的空間特征

    為確定mCRC的空間細胞特征,使用CODEX多路成像。這種方法在組織切片上使用25 plex抗體panel,從而能夠以單細胞分辨率進行細胞類型鑒定(圖5A)。這種空間成像使我們能夠提出關于肝臟mCRC TME中細胞類型和細胞鄰近性的具體問題。

    圖像經過處理后,發現共有來自15mCRC330893個單細胞。首先使用Harmony算法的低分辨率批量校正聚類對這些細胞進行聚類。細胞簇有來自不同腫瘤的貢獻,這一結果表明充分消除了批次效應(圖5B)?;诳贵w染色模式,鑒定了腫瘤上皮細胞、CAFs、巨噬細胞、內皮細胞、CD4 T細胞、CD8 T細胞和Tregs。通過比較相應的HE圖像來驗證細胞類型分配(圖5C5D)。不同的細胞類型在mCRC中具有不同的比例(圖5E)。五個樣本同時具有來自腫瘤不同部位的scRNA-seqCODEX結果。

    在確定了細胞類型后,作者檢測了表征不同細胞狀態的特定標志物的表達。這些標記物是從scRNA-seq結果中鑒定出來的。與其他細胞類型相比,TME巨噬細胞具有高表達的LGALS3;與其他細胞類型相比,CAFs具有高表達COL4A1(圖5F-5G)。這些結果獨立地證實了前面在scRNA-seq數據中發現的LGALS3–high SPP1+巨噬細胞??偟膩碚f,這一結果為scRNA-seq分析提供了額外的支持,該分析確定了巨噬細胞和CAFs之間的細胞間通信。


    5肝臟中mCRC TME的空間特征

     

    6、獨立mCRC數據集中CAFs對臨床結果的影響

    為驗證單細胞測序的發現,分析了從肝臟切除的93mCRCRNA-seq數據。值得注意的是,這些腫瘤中96.6%MSS。因此,腫瘤具有與用于scRNA-seq的隊列相同的基于肝臟的TME特征。使用去卷積方法CIBERSORTx來推斷該數據集中的細胞譜系部分。生成了每個細胞譜系的基因特征矩陣,該矩陣來源于腫瘤樣本特異性細胞,同時排除了正常肝組織和PBMC(圖6A)。該分析包括腫瘤上皮細胞和TME特異性CAF、SPP1+巨噬細胞、DC、內皮細胞、CD8 T、CD4 T、Treg、NK、B和漿細胞。將該特征矩陣應用于大量基因表達數據集導致每個樣本的每個譜系的細胞級分的量化。成功獲得了所有譜系的細胞分數。因此,腫瘤特異性單細胞特征可以在獨立的mCRC基因表達數據集中成功地去卷積。作者還評估了CAF豐度對預后的影響??偵媛什涣嫉?/span>CAFs比例顯著較高(圖6B)。因此,以大量CAF為特征的TME表型與較差的臨床結果有關。


    6、獨立mCRC數據集中CAFs對臨床結果的影響

     

    綜上,本研究揭示了mCRC TME的一個新特征,即在肝轉移中巨噬細胞和成纖維細胞之間存在細胞間網絡;使用scRNA-seq,確定了這些細胞之間不同的通信程序,這些程序有可能相互影響它們的細胞狀態;這一發現得到了空間分析的進一步支持,空間分析顯示這些細胞之間的距離非常近;巨噬細胞成纖維細胞網絡在含有Tregs的同時促進了缺乏抗腫瘤CD8 T細胞的免疫抑制TME;TME中成纖維細胞的增加與更差的患者結局有關(圖6C)。巨噬細胞和成纖維細胞因此調節肝臟轉移生態位,這代表了轉移級聯的“土壤”成分,可以進行腫瘤傳播。

     

    參考文獻

    Sathe A, Mason K, Grimes SM, Zhou Z, Lau BT, Bai X, Su A, Tan X, Lee H, Suarez CJ, Nguyen Q, Poultsides G, Zhang NR, Ji HP. Colorectal Cancer Metastases in the Liver Establish Immunosuppressive Spatial Networking between Tumor-Associated SPP1+ Macrophages and Fibroblasts. Clin Cancer Res. 2023 Jan 4;29(1):244-260. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-22-2041.


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