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  • 環狀RNA circHERC4作為一種新的致癌驅動因子,通過miR-556-5p/CTBP2/E-cadherin軸促進結直腸癌轉移

    欄目:最新研究動態 發布時間:2022-03-09
    目前有研究表明CircHERC4通過miR-556-5p/CTBP2/E-cadherin通路在促進腫瘤侵襲性中發揮關鍵作用,是疾病的預后......


    結直腸癌(CRC)患者死亡的主要原因是腫瘤轉移。越來越多的證據表明,circRNA在癌癥的起始和發展中發揮著關鍵作用。然而,circRNAs協同癌癥轉移的潛在分子機制仍不明確,需要進一步澄清。因此,目前有研究表明CircHERC4通過miR-556-5p/CTBP2/E-cadherin通路在促進腫瘤侵襲性中發揮關鍵作用,是疾病的預后生物標志物,證明CircHERC4可作為CRC患者的一個可開發的治療靶點。該研究發表在《Journal of HematologyOncology》,IF: 17.388。


    技術路線:


    主要研究結果:

    1. 結腸癌中circHERC4的識別和特征

    作者選擇結腸癌組織和配對的相鄰非腫瘤組織進行RNA序列分析,以獲得CircRNA的表達譜。根據fold change 10.0 P< 0.05,篩選了轉移相關的CircRNA,最后應用transwell侵襲試驗篩選出功能性CircRNA,最終篩選出circHERC4has_circ_0007113)(圖1a)。通過RNase R和放線菌素D處理后,HERC4 mRNA水平顯著下調,而circHERC4 mRNA水平保持不變(1c, d)。此外,通過核質分離后的qRT-PCR,發現circHERC4主要位于細胞質中(1e)。

    1 circHERC4CRC細胞中的鑒定和表征


    2.
    circHERC4而非HERC4 mRNA的過度表達與結腸癌患者預后不良相關

    qRT-PCR檢測120對組織樣本(120個癌組織和120個正常組織)中circHERC4的表達。結果表明,在結腸癌患者中,circHERC4的表達顯著增加(P<0.001)(圖2a)。circHERC4的高表達與淋巴轉移(P<0.01)(圖2b)和遠處轉移(主要是肝轉移)呈正相關(P<0.01)(圖2c)。對具有臨床特征的120例結腸癌患者進行相關分析,發現circHERC4表達與病理分期和組織學分級相關(表1)。circHERC4的過度表達與結腸癌中宿主HERC4mRNA無關(圖2d)。Kaplan-Meier生存分析顯示,circHERC4高表達的患者總體生存率較低(P<0.05)(圖2g)。HERC4 mRNA表達水平與患者預后無關(圖2h)。綜上所述,這些結果表明,circHERC4(而非其宿主HERC4 mRNA)CRC組織中顯著上調,而更高的circHERC4表達可能意味著預后不良。

    2 CircHERC4CRC組織中過表達并與轉移相關

    1 circHERC4低表達和高表達的CRC患者的臨床特點


    3.
    CircHERC4作為一種致癌基因,在體外和體內促進CRC的增殖、遷移和侵襲

    為了確定circHERC4的功能作用,檢測了circHERC4在人正常結腸上皮細胞、HCoEpicCRC細胞(HCT116、DLD-1、HT29、LoVoSW480)中的表達。結果發現circHERC4CRC細胞中的表達顯著上調,其中與HCoEpic細胞相比,circHERC4DLD-1HCT116細胞中的表達相對較高,而在SW480細胞中的表達相對較低(3a)。因此,選擇HCT116、DLD-1SW480細胞進行進一步研究。首先設計了針對circHERC4剪接序列的siRNAs(3b)。DLD-1HCT116細胞轉染circHERC4 siRNA,其成功沉默circHERC4,但未沉默HERC4 mRNA(圖3c)。根據CCK-8實驗,沉默circHERC4顯著抑制了DLD-1HCT116細胞的活力(3d)。集落形成實驗顯示,與NC相比,circHERC4下調組的DLD-1HCT116細胞增殖能力也受到抑制(3e)。此外,transwell實驗顯示,沉默circHERC4抑制了DLD-1HCT116細胞的遷移和侵襲能力(3f)。過表達circHERC4質粒轉染到SW480細胞中,發現circHERC4明顯增加(3g)。結果表明,circHERC4過表達顯著促進了體外CRC細胞的增殖、遷移和侵襲能力(3h-j)。

    異種移植和轉移小鼠模型也支持circHERC4在體內發揮致癌作用的觀點。干擾circHERC抑制腫瘤的生長速度和腫瘤重量 (3k-m)。與陰性對照組相比,sh-circHERC4組肺、肝轉移的發生率顯著降低(3n)。HE染色顯示sh-NC組轉移結節面積極高,而sh-circHERC4組轉移結節面積顯著降低(3o)。以上數據證實了circHERC4在體外和體內均能促進CRC的進展,特別是轉移。

    3 CircHERC4作為一種致癌基因,在體外和體內調節增殖、遷移和侵襲


    4.
    CircHERC4CRC細胞中直接與miR-556-5p結合

    在雙熒光素酶報告實驗中,miR-556-5p具有最大的熒光素酶活性抑制作用(4a)。RNA pull-down實驗后的qPCR結果顯示,circHERC4 mRNA顯著富集,而宿主HERC4 mRNA則不顯著富集。通過qPCR檢測circHERC4 pull-down部分中所有具有熒光素酶活性抑制作用的7miRNA。circHERC4 pull-down部分中miR-556-5p的富集顯著高于NC組和其他miRNAs(4b)。這些結果提示miR-556-5p直接與circHERC4結合,并可能參與了circHERC4CRC中的功能。


    4 CircHERC4通過與miR-556-5p相互作用促進CRC細胞增殖、遷移和侵襲


    5.
    抑制miR-5565p可介導circHERC4的致癌功能,激活CRC中的Notch信號通路

    qPCR檢測證實了miR-556-5pCRC組織中下調(4c),miR-556-5p在有淋巴轉移(4d)或遠處轉移(4e)患者中的表達水平要低得多。淋巴結轉移陽性的患者miR-556-5p水平較低,而其他特征與miR-556-5p的表達無顯著相關性(2)。miR-556-5p能顯著抑制CRC細胞的增殖、遷移和侵襲能力(4f-h)。拯救實驗中miR-556-5p模擬物可以部分恢復過表達circHERC4增強的SW480細胞的增殖、遷移和侵襲能力(4i-k)。綜上所示,這些結果提供了證據,表明miR-556-5p具有抗癌作用,并通過直接結合CRC部分介導circHERC4的致癌功能。

    根據維恩圖(5a),篩選出了9109個在circHERC4沉默和miR-556-5p過表達的DLD-1細胞中顯著改變的轉錄本。KEGG通路富集分析顯示,這9109個轉錄本富集在許多腫瘤相關信號通路中,尤其是與結腸癌發生相關的Notch信號通路(5b)。因此, circHERC4可能通過激活Notch信號通路促進細胞轉移,而Notch信號通路可能被miR-556-5p阻斷。

    5 CTBP2miR-556-5p的靶基因


    6.
    CTBP2miR-556-5p的靶點,通過抑制E-cadherin在結直腸癌中的表達而發揮致癌作用

    熱圖顯示Notch信號通路中大部分基因通過沉默circHERC4和過表達miR-556-5p而下調(5c)。結合生物信息學分析,CTBP2被預測為miR-556-5p的靶點(5d)。熒光素酶報告實驗表明miR-556-5p的過表達顯著降低了包括CTBP2野生型結合位點而不包括突變型結合位點的載體的熒光素酶活性(5d)。Western blot實驗證明,miR-556-5p可以顯著抑制CTBP2的蛋白水平,但卻挽救了CTBP2靶向E-cadherin的表達(5e)。

    GEPIA數據庫和免疫組化試驗發現CTBP2蛋白在結直腸癌組織中表達水平較癌旁正常組織上調(6a,b)。Kaplan Meier生存分析評估CTBP2高表達與CRC患者較低的生存概率顯著相關(6c)。敲除CTBP2促進E-cadherin蛋白表達水平下降(6d)。與NC相比,沉默CTBP2顯著抑制了細胞增殖 (6e-g),這些結果為CTBP2miR-556-5p的靶基因,其過表達通過抑制E-cadherin介導CRC腫瘤轉移提供了重要的認識。

    6 CTBP2CRC組織中過表達,可促進CRC細胞的進展


    7.
    沉默CTBP2可以消除過度表達circHERC4所引起的效應

    circHERC4被敲低時,CTBP2蛋白水平顯著下降。相反,CTBP2的下游靶蛋白E-cadherin在這些條件下顯著增加(6h),Ki-67circHERC4沉默后急劇下調(6i)。挽救實驗來研究circHERC4CTBP2之間的功能相互作用。與轉染空載體或siNC模擬物的SW480細胞相比,轉染CTBP2 siRNA模擬物的過表達circHERC4細胞的增殖、遷移和侵襲能力明顯下降(6j-l),circHERC4的致癌功能可以通過消除CTBP2的表達而部分逆轉。Western blotting結果顯示,CTBP2可以部分恢復circHERC4E-cadherin表達的影響(6m)。circHERC4CTBP2在高級別CRC組織中過表達,而miR-556-5p在低級別CRC組織中更豐富(7a)。異種皮下移植的結果表明,circHERC4過表達可加速腫瘤生長,注射CTBP2 siRNAmiR-556-5p mimic后,這種作用可被抑制(7b-d)。免疫組化實驗表明,沉默CTBP2或過表達miR-556-5p來部分挽救circHERC4CTBP2 Ki67促進、E-cadherin抑制的作用。在尾靜脈注射小鼠模型中,上調circHERC4可促進肺和肝臟轉移性結節的形成,當CTBP2下調或miR-556-5p上調時,circHERC4誘導的致癌作用被阻斷(7f-g)??偟膩碚f,這些結果證明CTBP2可以促進CRC的進展,并且在體內和體外都受到circHERC4/miR-556-5p軸的調控。

    7 CTBP2circHERC4/miR-556-5p相互作用的調控


    研究結論:

    綜上所述,該報告發現了一個之前未被發現的致癌驅動因子circHERC4CRC組織中升高,并與CRC的增殖、遷移和侵襲相關。此外,circHERC4CRC患者中的高表達與轉移和較差的生存率呈正相關。作者提出了circHERC4可以阻斷miR-556-5pCTBP2的抑制活性的機制。因此,沉默circHERC4可以下調CTBP2的表達,并伴隨E-cadherin的激活。該研究結果表明,circHERC4可能是一種潛在的預后生物標志物,沉默circHERC4CRC治療提供了一個新的治療靶點(8)。

    8 circHERC4通過miR-556-5p/CTBP2/E-cadherin信號通路促進CRC發病和轉移的機制示意圖


    參考文獻:

    He J, Chu Z, Lai W, et al. Circular RNA circHERC4 as a novel oncogenic driver to promote tumor metastasis via the miR-556-5p/CTBP2/E-cadherin axis in colorectal cancer. J Hematol Oncol. 2021; 14(1):194.


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