<dd id="fncnt"><pre id="fncnt"></pre></dd>

  • ENSA拷貝數擴增通過調控膽固醇生物合成促進三陰性乳腺癌的進展

    欄目:最新研究動態 發布時間:2022-03-08
    作為癌癥的一個標志,拷貝數變化(CNAs)在癌癥中無處不在。本研究中,作者探索TNBC中新的受CNAs影響的基因......


    三陰性乳腺癌(TNBC)約占所有乳腺癌病例的10-20%。其特點是雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)表達陰性,HER2無過表達(也可定義為ERBB2無擴增)。與其他形式的乳腺癌相比,TNBC具有更強的侵襲性臨床特征,包括起病年齡更小、腫瘤體積更大、腫瘤分級更高、轉移潛力更顯著。TNBC患者遠端復發和5年內死亡的風險增加。作為癌癥的一個標志,拷貝數變化(CNAs)在癌癥中無處不在。本研究中,作者探索TNBC中新的受CNAs影響的基因。本文于20221月發表于《Natural communication》,IF=12。121。


    本文技術路線:

     


    本文主要結果:

    1、整合DNA拷貝數和轉錄組分析顯示TNBC1q21。3區域的ENSA擴增

    為了確定TNBCCNAs驅動的基因表達異常,首先根據TNBC隊列的CNA數據和RNA-seq數據篩查CNA影響的癌基因。共發現41個基因,其中,ENSA和GOLPH3L是TNBC中最常見的擴增基因(18.5%的患者擴增,57.6%的患者拷貝數增加),位于1q21.3區域(Figure 1a)。在TCGA數據庫中,約11%的乳腺癌患者中也發現1q21.3片段擴增(Figure 1b),并且無病生存期和疾病特異性生存期更差(Figure 1c)。作者進一步研究了TCGA隊列中不同亞型乳腺癌1q21.3改變的差異。發現TNBC(27.7%)及其亞型(32。6%)擴增較高(Figure 1d)。為了在感興趣的1q21.3位點中識別潛在的腫瘤促進基因,作者在the Kaplan-Meier plotter數據庫中發現ENSA的表達升高,ENSA的高表達與TNBC患者的無復發生存率低有關(Fig 1e,f)。此外,ENSA在腫瘤組織中的表達高于正常組織,在TNBC中隨著基因擴增而增加(Fig 1g,h)。這些結果表明,ENSA在1q21.3區域擴增,在TNBC中具有臨床預后價值。

    Fig1 ENSA1.21.3區域擴增,呈高表達,預示TNBC生存率較低

    2、ENSA促進TNBC細胞的生長

    為了確定ENSATNBC中的作用,作者用shRNA敲除了ENSA的表達,并在ENSA表達相對較高的兩種TNBC細胞系BT549MDA-MB-231中恢復了ENSA最常見的轉錄本的表達(Fig 2a)。結果發現,ENSA下調對TNBC細胞生長和集落形成有明顯的抑制作用(Fig 2b, c)。此外,過表達ENSATNBC細胞中減弱了ENSA沉默對細胞生長和菌落形成的抑制作用(Fig 2d,e)。ENSA下調也明顯引起TNBC細胞的凋亡,但對細胞周期進程幾乎沒有影響(Fig 2f)。這些結果表明ENSA在促進TNBC細胞生長方面具有重要作用。

    Fig2 ENSATNBC細胞生長的主要驅動力


    3
    、ENSATNBC中膽固醇的生物合成中起關鍵作用

    為了探討ENSA的分子機制,作者對ENSA敲除細胞和對照細胞進行了RNA測序分析?;蚣患治?/span>(GSEA)顯示,在ENSA沉默的細胞中,膽固醇通路是最富集的下調通路(Fig 3a,b)。此外,GSEA顯示ENSA沉默的細胞凋亡通路上調,與ENSA缺失誘導的促凋亡表型一致(Fig 3c)。作者利用基因組變異分析進一步探討了ENSA表達TNBC隊列中膽固醇生物合成通路活性之間的相關性。作者發現ENSA mRNA表達與TNBC中膽固醇生物合成程序之間存在顯著的正相關(Fig 3d)。在表達ENSA shRNATNBC細胞中檢測mRNA和蛋白水平,進一步驗證了膽固醇生物合成酶SREBP2(一種優先激活膽固醇生物合成基因的關鍵轉錄因子)表達的降低(Fig 3e,f)。重要的是,SREBP2的完整形式和切割形式的蛋白水平都降低了,這與ENSA沉默后SREBP2 mRNA水平的降低是一致的(Fig 3f)。為了確定膽固醇生物合成途徑的主要產物是否發生了變化,作者采用液相色譜-質譜聯用技術檢測膽固醇及其中間代謝物的含量。與膽固醇生物合成相關基因mRNA和蛋白表達下調相一致,ENSA沉默后,TNBC細胞中總膽固醇濃度降低(Fig 3g,h)。此外,ENSA敲除后,TNBC細胞中游離膽固醇含量顯著降低(Fig 3i)。接下來,作者研究了ENSA敲除誘導的表型是否與膽固醇消耗有關。發現ENSA敲除的TNBC細胞中,添加膽固醇可部分抑制ENSA缺失細胞的生長,增加細胞凋亡(Fig 3j)??傊?,這些發現支持ENSA可能通過調節細胞膽固醇生物合成促進TNBC細胞生長的觀點。

    Fig 3 ENSATNBC中膽固醇的生物合成中起關鍵作用


    4
    、激活的STAT3參與ENSA誘導的腫瘤生長

    為了闡明ENSA消耗誘導TNBC細胞表型的分子機制,作者對RNA-seq數據進行轉錄因子(TF)分析并假設STAT3是調控下游的關鍵轉錄因子(Fig 4A)。在TNBC細胞中,p-STAT3 (Tyr705),而不是p-STAT3(Ser727)或總STAT3,在ENSA敲除后顯著降低(Fig 4b)。ENSA過表達恢復了p-STAT3 (Tyr705)的表達(Fig 4c)。接下來,作者通過在ENSA沉默的TNBC細胞中過表達STAT3,證實了STAT3參與ENSA敲除誘導的生長抑制(Fig 4b)。ENSA過表達恢復p-STAT3 (Tyr705)水平(Fig 4c)。接下來,作者通過在ENSA沉默的TNBC細胞中過表達STAT3來誘導STAT3的組成性激活/磷酸化,證實了STAT3參與ENSA敲除誘導的生長抑制。作者的結果表明,過表達STAT3可以部分減弱ENSA缺失引起的TNBC細胞生長抑制(Fig 4d,e)。在小鼠乳腺脂肪墊異種移植瘤中,ENSA敲除可顯著降低MDAMB- 231細胞的腫瘤生長,ENSA過表達可完全挽救MDAMB- 231細胞的腫瘤生長,而STAT3過表達可挽救MDAMB- 231細胞的腫瘤生長(Fig 4f,g)。在免疫組織中,ENSA沉默后,染色p-STAT3 (Tyr705)顯著降低。然而,在ENSA敲除的TNBC腫瘤中,ENSASTAT3過表達均增加p-STAT3 (Tyr705)染色(Fig 4h)。根據體外ENSA缺失誘導的促凋亡表型,在各組異種移植體中cleaved caspase 3IHC染色表現出相應的變化(Fig 4h)。綜上所述,這些數據表明ENSA-STAT3信號在促進三陰性腫瘤生長中發揮了關鍵作用。

    Fig 4 ENSA通過激活STAT3促進腫瘤生長


    5
    、ENSA激活STAT3來調節膽固醇的生物合成

    接下來,探討激活STAT3是否參與了ENSA誘導的膽固醇生物合成途徑的改變。JASPAR數據庫的預測顯示,STAT3可能與SREBP2的啟動子結合(Fig 5a)。在 Chip實驗中,作者證實STAT3SREBP2的啟動子區域存在一個結合位點(Fig 5b)。此外,在TNBC細胞中沉默STAT3可以抑制SREBP2 mRNA和蛋白的表達(Fig 5c)。這些結果表明,在TNBC細胞中,STAT3可以與SREBP2的啟動子結合,并在轉錄水平上改變SREBP2的表達(Fig 5b)。此外,在TNBC細胞中沉默STAT3可以抑制SREBP2 mRNA和蛋白的表達(Fig 5c)。這些結果表明,STAT3可以與SREBP2的啟動子結合,并在轉錄水平上改變SREBP2的表達。作者接下來驗證了啟動子的活性,基于熒光素酶報告基因檢測,發現SREBP2ENSA耗盡所抑制,隨著STAT3過表達被拯救(Fig 5d)。當ENSA敲低時,SREBP2和參與膽固醇生物合成的酶的表達水平持續下降,但這種效應被STAT3過表達逆轉(Fig 5e)。此外,ENSA耗盡后細胞游離膽固醇水平降低,STAT3過表達也可使其恢復(Fig 5f )。

    作者下一步探究ENSA敲除對p-STAT3的抑制作用是否依賴于蛋白磷酸酶2A (PP2A),PP2A是一種已知的蛋白磷酸酶,其功能被ENSA直接作用所抑制。作者在MDAMB-231細胞中利用PP2A的靶向siPPP2CA亞基催化PP2A沉默,促進p-STAT3 (Tyr705)表達增加(Fig 5g)。然而,p-STAT3 (Ser727)不受PP2A沉默的影響。此外,ENSA缺失對p-STAT3 (Tyr705)和SREBP2表達的抑制作用被TNBC細胞中PP2A的進一步下調所削弱(Fig。 5h)。這些提示ENSA可能以PP2A依賴的方式促進STAT3磷酸化調控TNBC細胞膽固醇合成。

    Fig5 ENSA激活STAT3pp2a依賴的方式促進SREBP2的轉錄

     

    6、ENSA決定對STAT3抑制劑的治療敏感性

    由于ENSA調節STAT3的活性,作者試圖評估ENSA是否可以作為TNBC細胞中STAT3抑制劑敏感性的治療標志物。作者使用STAT3作為STAT3激活的小分子抑制劑。與ENSA敲除組相比,ENSA水平較高的對照組對抑制劑更敏感,且在抑制劑處理后,增長顯著下降(Fig 6a,b)。在3ENSA表達水平不同的TNBC患者的類器官中,作者也發現類器官對抑制劑的敏感性隨著ENSA表達水平的增加而增加(Fig 6c-e)。此外,在異種移植模型中,當ENSA耗盡時,發現TNBC細胞對抑制劑的敏感性顯著降低(Fig 6f,g)。為了進一步探討TNBC患者對藥物的反應,作者構建了7個患者來源的小異種移植(mini-PDX)模型,并測量了歸一化的抑制劑對治療的反應(Fig 6h)。結果發現,ENSA高表達的腫瘤的敏感性高于ENSA相對低表達的腫瘤(Fig 6i,j)??傊?,作者的TNBC細胞系、類器官、動物模型和mini-PDX模型的結果都表明,ENSA表達可以作為STAT3抑制劑有效治療的生物標志物。

    Fig6 ENSATNBC中的Stattic抑制劑敏感性有關


    7、ENSA
    、p-STAT3SREBP2在臨床樣本和患者預后中的表達相關性

    為了探討作者研究結果的臨床相關性,作者首先用免疫組化法檢測了8TNBC原發標本和相鄰正常組織中ENSA蛋白的表達水平。結果顯示,TNBC標本中ENSA蛋白水平明顯高于正常組織(Fig 7a,b)。為了探討ENSA蛋白表達與患者生存的相關性,作者收集138TNBC患者的手術標本,通過免疫組化分析檢測ENSA蛋白表達水平(Fig 7c)。樣本Kaplan-Meier分析顯示,ENSA水平高的腫瘤患者的無復發生存期和總生存期往往比ENSA水平低的患者更差(Fig 7d)。作者進一步檢測了SREBP2、HMGCRp-STAT3(Tyr705)的蛋白表達水平。免疫組化結果顯示ENSA表達與SREBP2, HMGCR,p-STAT3 (Tyr705)呈正相關(Fig 7f)??傊?,這些結果表明ENSA的表達與下游分子的表達呈正相關,在TNBC中是一個不良預后因素。

    Fig7 ENSA、SREBP2、pSTAT3-Tyr705與臨床樣本生存率的相關性

     

    本研究表明ENSA,是一個通過促進TNBC中膽固醇生物合成來觸發腫瘤生長的基因。ENSA-PP2A-STAT3-SREBP2調控軸表征了其潛在機理。作者認為STAT3抑制劑Stattic可能是治療ENSA表達的TNBC的重要方法。


     參考文獻:

    Chen, Y.Y., et al., Copy number amplification of ENSA promotes the progression of triple-negative breast cancer via cholesterol biosynthesis. Nat Commun, 2022. 13(1): p. 791.

     


    999国产精品永久免费视频,free性朝鲜娇小videos,亚洲高清国产拍精品26u,东北女人毛多水多牲交视频