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  • lncRNA穩定表達后與蛋白結合促進腫瘤惡性進展

    欄目:最新研究動態 發布時間:2021-12-15
    研究發現lncRNA THAP7-AS1被SP1轉錄激活然后被METTL3介導的m6A修飾穩定,進而提高CUL4B進入核中,從而發揮了原癌特性......


    LncRNA在不同癌癥類型中異常調節被認為是人類癌癥發生和進展的重要調控元素。但是其在胃癌(GC)中的作用仍有較大空白。本研究發現lncRNA THAP7-AS1SP1轉錄激活然后被METTL3介導的m6A修飾穩定,進而提高CUL4B進入核中,從而發揮了原癌特性。本文于202110月發表在《Cell Death and DifferentiationIF15.828期刊上。

     

    技術路線:


    主要實驗結果:

    1、THAP7-AS1在伴有淋巴結轉移的胃癌樣本中上調

    對10例GC樣本和2例非腫瘤胃組織進行芯片分析,獲得lncRNA的差異表達譜,包含989個上調lncRNA(圖1A)。只有2個lncRNA,LOC100133669和THAP7-AS1滿足以下條件:差異倍數大于5,P<0.05,在GC中顯著上調(圖1B)。但是在72個GC臨床樣本中,只有THAP7-AS1在淋巴結轉移(LNM)的組織中的表達顯著非LNM組織(圖1C-D)。因此被初步選為候選基因。隨后發現THAP7-AS1同時定位于細胞核和細胞質,并能穩定表達(圖1E-J)。

     

    1 THAP7-AS1在伴有淋巴結轉移的胃癌樣本中上調

     

    2、在GC細胞中SP1激活THAP7-AS1的轉錄

    對THAP7-AS1進行啟動子分析,如圖2A-B,啟動子207區域活性顯著低于509區域,表明-509-207區域是THAP7-AS1完整轉錄活性所需要的。隨后預測了5個與THAP7-AS1結合的轉錄因子,發現當過表達SP1,KLF5,EGR1后THAP7-AS1啟動子509-0區域活性顯著升高,但是只有SP1可以促進THAP7-AS1的表達(圖2C-E)。為了確定SP1上3個與THAP7-AS1結合的位點的實際作用,進行了單位點突變實驗,結果顯示SP1-1,SP-1-2和SP-1-3突變質粒的THAP7-AS1啟動子的活性顯著下降,且下降倍數不同,表明3個結合位點各自獨立作用(圖2F-G)。ChIP結果顯示,SP1可以和THAP7-AS1啟動子之間結合,并且兩者的表達呈正相關(圖2H-J)。以上表明SP1結合THAP7-AS1啟動子進而激活其轉錄。

    圖2(上部分)THAP7-AS1由SP1激活

     

    3、METTL3介導m6A修飾通過IGF2BP1依賴的RNA穩定性增強THAP7-AS1表達

    m6A修飾被認為是最普遍的內部RNA修飾,涉及到RNA的降解,穩定性和剪切。為了評估m6A修飾在THAP7-AS1轉錄后調控中的重要作用,對THAP7-AS1序列進行了m6A修飾預測,發現其包含7個潛在的修飾位點。MeRIP實驗結果顯示THAP7-AS1確實存在m6A修飾(圖2K-L)。此外,過表達或敲除METTL3,而不是METTL14,可以顯著性增加或減少THAP7-AS1的水平(圖2M-P)。并且和非LNM組織比較,METTL3的表達在LNM中顯著上調,其表達和THAP7-AS1表達呈正相關關系(圖2Q-R)。RNA pull-down實驗表明THAP7-AS1可以和METTL3直接結合(圖2P-Q)。敲除IGFBP1,而不是IGFBP2-3,導致THAP7-AS1表達下降,并且敲除IGFBP1后THAP7-AS1的穩定性下降,RIP也發現IGFBP1和THAP7-AS1的直接結合(圖2S-U)。此外,在METTL3沉默的GC細胞中,IGFBP1和THAP7-AS1的結合顯著下降。因此,以上表明METTL3介導的m6A修飾通過IGFBP1依賴的增強THAP7-AS1穩定性提高其表達。

    圖2(下部分)THAP7-AS1由METTL3介導的m6A修飾轉錄后穩定

     

    4、THAP7-AS1促進GC細胞體內外的生長,遷移和侵襲

    如圖3所示,過表達THAP7-AS1顯著促進GC細胞的增殖,遷移和侵襲,沉默則相反。在體內,過表達THAP7-AS1增加了腫瘤體積,和肺轉移。

     

    圖3 THAP7-AS1促進GC細胞體內外的生長,遷移和侵襲

     

    5、THAP7-AS1結合CUL4B的核定位信號區域,介導CUL4B進入細胞核

    近來研究表明lncRNA通過和蛋白質相互作用發揮功能,作者推測THAP7-AS1也可能是通過這種方式介導GC惡性表型。RNA pull-down和MS實驗鑒定了與THAP7-AS1結合的蛋白,包括CUL4B和STAT3(圖4A)。但是只有CUL4B在GC細胞中特異性結合THAP7-AS1(圖4B-D)。隨后,作者構建了一系列截斷突變體去探究它和CUL4B的結合區域,發現THAP7-AS1的1-442nt區域是和CUL4B結合所必須的(圖4E)。FISH證實了兩者的共定位(圖4F),但是作者發現THAP7-AS1并不能改變CUL4B的表達(圖5A,E),提示THAP7-AS1不參與CUL4B的轉錄后調控。有趣的是,慢病毒轉染THAP7-AS1后,細胞質中CUL4B表達減少,細胞核中CUL4B表達增加(圖4G-H),表明THAP7-AS1促進CUL4B蛋白進入細胞核。進一步研究發現THAP7-AS1提高了NLS和importin α1的結合能力(圖4I-K),并且THAP7-AS1直接結合CUL4B的NLS區域(圖4L-O);THAP7-AS1也可以直接結合importin α1(圖4P-S)。表明THAP7-AS1與importin α1和CUL4B的NLS區域結合,從而促進CUL4B和importin α1的結合。隨后的挽救實驗證實了THAP7-AS1的生物學功能是通過CUL4B的核易位(圖4T-U)??傊?,以上表明THAP7-AS1結合CUL4B的核定位信號區域,介導CUL4B進入細胞核,進而促進了GC細胞的惡性表型。

     

     

    圖4 THAP7-AS1結合CUL4B的核定位信號區域,介導CUL4B進入細胞核

     

    6、THAP7-AS1/CUL4B復合物可啟動miR-22-3p/miR-320抑制PI3K/AKT信號通路

    為了鑒定參與THAP7-AS1/CUL4B復合物介導的生物學功能的潛在基因,對si-THAP7-AS1和對照HC細胞進行了RNA測序。與對照相比,在THAP7-AS1/CUL4B干擾組總計獲得6502個上調基因,5794個下調基因。如圖5的WB和RT-qPCR結果所示,PI3K/AKT信號通路上的基因,包括PIK3CA,PIK3CD,AKT3,顯著響應THAP7-AS1或CUL4B的干擾或過表達處理;白合成抑制劑環己亞胺(CHX)和蛋白酶體抑制劑MG132處理實驗結果表明,THAP7-AS1/CUL4B是在轉錄后水平調控上述PI3K/AKT信號通路上的基因表達,而不影響他們的穩定性和降解。

    圖5 THAP7-AS1/CUL4B復合物啟動PI3K/AKT信號通路

     

    鑒于miRNAs常見的轉錄后負調控因子,所以作者猜測miRNA可能參與CUL4B對PI3K/AKT信號通路上的基因表達的調控。如圖6所示,作者使用GSE數據和在線預測獲得了5個候選miRNAs,進一步驗證后鎖定了miR-22-3p/miR-320a,隨后實驗證實AKT3是miR-22-3p的靶基因,而miR-320a 可同時靶向調節PIK3CA,PIK3CD,AKT3蛋白的表達,挽救實驗也再次證實了這個結果??傊?,以上表明THAP7-AS1/CUL4B復合物通過miR-22-3p/miR-320靶向抑制PI3K/AKT信號通路。

     

    圖6 THAP7-AS1/CUL4B復合物可啟動miR-22-3p/miR-320a抑制的PI3K/AKT信號通路

     

    7、THAP7-AS1/CUL4B復合物轉錄抑制miR-22-3p/miR-320a表達通過CUL4B催化H2AK119ub1EZH2介導的H3K27me3

    研究發現CUL4B通過單泛素化H2AK119調控腫瘤抑制子的表觀遺傳失活。EZH2是PRC2的催化亞基,對于形成穩定的、酶活性強的甲基轉移酶復合物至關重要。為了檢測miR-22-3p和miR320a的表達是否受到上述表觀遺傳修飾的調控,用5-AZ、TSA和Dznep處理GC細胞,結果發現它們的表達在TSA和Dznep組顯著上調(圖7A-B),表明其啟動子存在組蛋白甲基化和組蛋白乙?;???笴UL4B、EZH2、H2AK119ub1、H3K27me3、HDAC1和HADC2或對照IgG的ChIP檢測顯示,CUL4B(圖7C, G)、EZH2(圖7D, H)、H3K27me3(圖7E, I)和H2AK119ub1(圖7F, J),有效地免疫沉淀了miR-22-3p和miR-320a的啟動子區域,表明它兩可被CUL4B催化的單泛素化H2AK119和PRC2-介導的H3K27me3調控。

    敲除CUL4B導致CUL4B,EZH2,H3K27me3,H2AK119ub1綁定到miR-22-3p和miR-320a啟動子顯著減少。這表明CUL4B調節miR-22-3p和miR320a的轉錄抑制是通過招募PRC2(圖7K-R)。THAP7-AS1過表達導致與miR-22-3p和miR-320a啟動子結合的CUL4B和EZH2顯著增加,表明THAP7-AS1參與了CUL4B介導的PRC2招募(圖7S-V)。CUL4B敲低逆轉了THAP7- AS1過表達引起的pri-miR-22-3p/pri-miR-320a的下降,反之亦然(圖7W, X)。綜上所述研究表明THAP7-AS1/CUL4B復合物通過CUL4B催化的H2AK119ub1和ezh2介導的H3K27me3在轉錄水平抑制miR-22-3p/miR-320a的表達。

    圖7 THAP7-AS1-CUL4B復合物可通過CUL4B催化的H2AK119ub1和EZH2介導的H3K27me3轉錄抑制miR-22-3p/miR-320a的表達

     

    8、THAP7-AS1可作為胃癌患者的預后和治療標志物

    如圖8所示,THAP7-AS1高表達患者的LNM危險性更高,總體生存率更差,敲除THAP7-AS1后腫瘤大小和腫瘤下降,Ki67陽性率下降。提示THAP7-AS1可作為胃癌患者的預后和治療標志物。

    圖8 THAP7-AS1可作為胃癌患者的預后和治療標志物

     

    綜上所述,lncRNA在人GC組織中產生了差異表達譜。THAP7-AS1是一種新的促進GC進展的lncRNA,由SP1轉錄激活,并由METTL3介導的m6A修飾轉錄后穩定。此外,THAP7-AS1促進了CUL4B與importin α1的結合,并增強了CUL4B蛋白進入細胞核的能力。THAP7-AS1/CUL4B復合物通過CUL4B催化的H2AK119ub1和ezh2介導的H3K27me3轉錄抑制miR-22-3p和miR-320a,從而激活PI3K/ AKT信號通路(圖8H)。本研究結果突出了GC中lncRNA、miRNA和蛋白之間重要的功能相互作用,提示THAP7-AS1可能成為GC治療的一個有前景的分子靶點。

     

    參考文獻:

    Liu Hai-Ting., Zou Yong-Xin., Zhu Wen-Jie., Sen-Liu., Zhang Guo-Hao., Ma Ran-Ran., Guo Xiang-Yu., Gao Peng.(2021). LncRNA THAP7-AS1, transcriptionally activated by SP1 and post-transcriptionally stabilized by METTL3-mediated m6A modification, exerts oncogenic properties by improving CUL4B entry into the nucleus. Cell Death Differ, undefined (undefined), undefined. Doi: 10.1038/s41418-021-00879-9


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