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  • lncRNA-ZNF649-AS1誘導曲妥珠單抗耐藥

    欄目:英拜特色服務 發布時間:2022-08-17
    lncRNAs在曲妥珠單抗耐藥中的調控機制至今尚未建立。今天為大家帶來發表于影響因子為8.986......

        lncRNAs在曲妥珠單抗耐藥中的調控機制至今尚未建立。今天小編為大家帶來發表于影響因子為8.986的“Molecular Therapy”上的文章“lncRNA ZNF649-AS1 Induces Trastuzumab Resistance by Promoting ATG5 Expression and Autophagy”,為大家詳細介紹lncRNA ZNF649-AS1在曲妥珠單抗耐藥中調控的機制。

        我們的結果顯示,與敏感細胞相比,ZNF649-AS1在曲妥珠單抗耐藥細胞中表達更高。ZNF649-AS1的表達增加與乳腺癌患者的不良反應和較短的生存時間有關。在曲妥珠單抗處理下,H3K27ac修飾上調了ZNF649-AS1,敲除ZNF649-AS1通過調節ATG5表達和自噬逆轉曲妥珠單抗的耐藥性。機制上,ZNF649-AS1與PTBP1蛋白相關,進一步促進了ATG5基因的轉錄活性。
    技術路線:

    結果:
    1.lncRNA ZNF649-AS1在曲妥珠單抗耐藥乳腺癌細胞中上調
        為了確定與曲妥珠單抗耐藥密切相關的lncRNAs,我們使用已建立的曲妥珠單抗耐藥細胞進行HiSeq測序。分散圖和火山圖用于評估抗曲妥珠單抗治療的SKBR-3細胞(SKBR-3-TR細胞)和SKBR-3細胞(圖1A和1B)之間基因表達的變化??偣灿?39個lncRNAs被鑒定為顯著差異表達(圖1C)。為了確定最有前景的lncRNAs,我們將分析重點放在前20個上調和20個下調的lncRNAs上,如圖1D中的熱圖所示。我們從上調最多的組中選擇了三個候選的lncRNAs,從下調最嚴重的組中選擇了兩個。我們檢測了30例HER2+患者配對乳腺癌組織和癌旁非腫瘤組織中所選基因的表達。ZNF649-AS1是上調幅度最大的lnRNA(圖1E)。此外,與親代細胞相比,抗曲妥珠單抗治療的SKBR-3-TR細胞和BT474細胞(B7474-TR細胞)中的ZNF649AS1顯著上調(圖1F)。

    2.lncRNA-ZNF649-AS1與曲妥珠單抗治療的不良反應相關
        為了驗證ZNF649-AS1是否與曲妥珠單抗治療相關,我們檢測了60例接受曲妥珠單抗治療的乳腺癌組織中ZNF649-AS1的表達。如圖2A所示,與有反應的患者相比,無反應患者的ZNF649-AS1上調。接著,90份接受曲妥珠單抗治療的患者的血清樣本被用來檢測ZNF649-AS1的表達。與有反應的患者相比,ZNF649-AS1在無反應患者中顯著上調(圖2B)。此外,ROC曲線顯示ZNF649-AS1表達具有較高的診斷價值(圖2C)。通過將患者分為高或低ZNF649-AS1表達組,使用從ROC曲線獲得的分層標準,我們發現高ZNF649-AS1表達組對曲妥珠單抗治療反應的患者比例遠低于ZNF649-AS1低表達組(圖2D)。更重要的是,Kaplan-Meier生存分析表明,高表達的ZNF649-AS1與整體生存率和無進展生存率相關(圖2E)。

    3.曲妥珠單抗通過誘導H3K27乙?;黾覼NF649-AS1的表達
        接下來,我們研究了曲妥珠單抗耐藥細胞中ZNF649-AS1上調的潛在機制。通過分析轉錄修改區域,我們發現在7個細胞系中,在ZNF649-AS1啟動子區上游有一個富集的H3K27ac結合區(圖3A)。然后我們使用抗H3K27ac抗體進行染色質免疫沉淀(ChIP)分析,發現H3K27ac在ZNF649-AS1啟動子區富集。此外,與親代細胞相比,SKBR-3-TR和BT474-TR細胞中H3K27ac的富集水平顯著提高(圖3B)。為了進一步證實曲妥珠單抗治療的效果,我們用曲妥珠單抗處理SKBR-3和BT474細胞48小時。如圖3C和3D所示,與對照細胞相比,曲妥珠單抗處理細胞中H3K27ac富集和ZNF649-AS1水平增加。與化療敏感患者相比,曲妥珠單抗耐藥患者乳腺癌組織中H3K27ac富集也增加(圖3E)。然后我們用C646(一種著名的乙酰轉移酶抑制劑)處理細胞,發現H3K27ac富集和ZNF649-AS1表達被顯著抑制(圖3F和3G)??偟膩碚f,我們的結果表明曲妥珠單抗處理通過誘導啟動子區域H3K27ac富集來增加ZNF649-AS1的水平。

    4.沉默lncRNA-ZNF649-AS1逆轉乳腺癌細胞曲妥珠單抗耐藥性
        為了確定ZNF649-AS1在曲妥珠單抗耐藥中的作用,我們使用特異性抑制劑沉默了ZNF649-AS1的表達。如圖4A所示,我們觀察到轉染siRNA的細胞中ZNF649-AS1的表達顯著降低。實時細胞分析(RTCA)顯示,ZNF649-AS1的敲除顯著抑制曲妥珠單抗治療后的細胞活性(圖4B)。此后,我們評估了它在細胞凋亡中的作用。TUNEL試驗結果顯示,ZNF649-AS1敲除后細胞凋亡增加(圖4C)。接下來,我們研究了ZNF649-AS1過表達對SKBR-3和BT474親本細胞抗曲妥珠單抗抗性的影響。如圖4D所示,轉染ZNF649-AS1質粒后,ZNF649-AS1在這些細胞中過表達。通過使用曲妥珠單抗處理SKBR-3和BT474細胞,我們發現與對照組相比,ZNF649-AS1誘導的對曲妥珠單抗的抗性增強(圖4E)。此外,ZNF649-AS1可抑制SKBR-3和BT474細胞的凋亡(圖4F)。

    5.lncRNA ZNF649-AS1對曲妥珠單抗誘導的自噬是必需的
        通過GO分析,我們假設自噬可能參與了ZNF649-AS1的功能(圖5A)。為了驗證這一假設,我們測量了自噬標記物的LC3和p62水平。值得注意的是,曲妥珠單抗耐藥細胞比相應的親代細胞顯示出更高的LC3-II和更低的p62蛋白水平,這表明當發生化療耐藥時,自噬通量被誘導(圖5B)。曲妥珠單抗耐藥細胞顯示出LC3斑點(圖5C)和自噬體(圖5D)的形成增加。為了驗證自噬是否對曲妥珠單抗耐藥至關重要,我們用氯喹(CQ)處理曲妥珠單抗耐藥細胞。結果表明,CQ處理抑制了自噬,并逆轉了化療耐藥狀態(圖5E和5F)。
        接下來,我們研究了ZNF649-AS1在自噬活性中的作用。ZNF649-AS1基因敲除導致SKBR-3-TR中LC3-II水平降低,p62水平增強。相反,在ZNF649-AS1過表達的細胞中,LC3-II水平增加,而p62水平降低(圖5G)。沉默SKBR-3-TR細胞中的ZNF649-AS1減少了LC3斑點的數量并阻止了自噬體的形成,而ZNF649-AS1的過表達導致SKBR-3細胞中LC3斑點和自噬體的數量增加(圖5H和5I)。綜上所述,我們的結果表明曲妥珠單抗耐藥誘導自噬活性增強,而抑制ZNF649-AS1可以逆轉自噬,從而誘導化療敏感性。

    6.ZNF649-AS1通過上調ATG5誘導曲妥珠單抗耐藥和自噬
        為了找到導致ZNF649-AS1誘導的自噬和曲妥珠單抗抗性的基因,我們分析了ZNF649-AS1和靶mRNAs的共表達網絡(圖6A)。有趣的是,我們發現了一個自噬相關的mRNA,ATG5,它被ZNF649-AS1靶向。與親代細胞相比,在轉錄和蛋白質水平上,SKBR-3-TR和BT474-TR細胞中ATG5上調(圖6B)。此外,與對治療有反應的患者相比,對曲妥珠單抗耐藥的患者組織中ATG5上調(圖6C)。根據從Pan-Cancer Atlas獲得的數據,ZNF649-AS1與ATG5表達略有正相關(圖6D)。在接受曲妥珠單抗治療的HER2+患者的60個組織中進一步證實了這種相關性(圖6E)。接下來,我們試圖確定ATG5是否對ZNF649AS1調節的曲妥珠單抗耐藥性至關重要。我們發現ATG5的抑制減弱了曲妥珠單抗耐藥細胞的化療耐藥性(圖6F),而增加ATG5則促進了親代細胞對曲妥珠單抗的耐藥性(圖6G)。此外,ATG5的抑制消除了ZNF649-AS1在敏感細胞中誘導的曲妥珠單抗耐藥性(圖6H),而增強的ATG5消除了ZNF649-AS1敲除誘導的耐藥細胞的化學敏感性(圖6I)。

    7.ZNF649-AS1通過招募PTBP1激活ATG5的轉錄
        我們用細胞分離PCR發現ZNF649-AS1主要分布在乳腺癌細胞的細胞質中(圖7A)。RNA熒光原位雜交(RNA-FISH)證實了這一結論(圖7B),表明ZNF649-AS1在轉錄后水平上調節下游通路?;贛FE評估,我們預測981-1190 nt位點的ZNF649-AS1轉錄物形成了莖環結構(圖7C),這對于與靶向RNA結合蛋白的關聯至關重要。為了驗證與ZNF649-AS1相關的蛋白質,進行了RNA下拉和質譜分析。我們發現了PTBP1,它可能參與定位、翻譯起始和mRNA穩定性。通過設計ZNF649-AS1探針并進行RNA下拉分析,我們發現PTBP1蛋白被ZNF649-AS1富集(圖7D)。此外,RNA免疫沉淀(RIP)試驗證實ZNF649-AS1是由PTBP1抗體沉淀的(圖7E)。這些發現提示ZNF649-AS1與PTBP1蛋白相關,發揮重要的生物學功能。
        我們試圖證明ZNF64-AS1通過與PTBP1結合來提高ATG5的mRNA穩定性。圖7F顯示PTBP1的沉默下調了ATG5的mRNA水平。此外,PTBP1的沉默消除了ZNF649-AS1誘導的ATG5 mRNA的增加(圖7G)。為了確定PTBP1的作用,我們進行了RIP分析。ZNF649-AS1的過表達增加了SKBR-3細胞中與ATG5結合的內源性PTBP1,而敲除ZNF649-AS1在SKBR-3TR細胞中產生相反的作用(圖7H)。此外,我們用
    actinomycin D 處理曲妥珠單抗耐藥細胞,該actinomycin D廣泛用于阻斷轉錄過程,并發現沉默ZNF649-AS1或PTBP1導致ATG5 mRNA降解增加(圖7I)。此外,ZNF649-AS1的過表達增加了半衰期,而PTBP1的敲除使半衰期回到正常水平(圖7J)。因此,我們的結果證明,ZNF649-AS1結合的PTBP1通過提高mRNA的穩定性來增加ATG5的表達水平。

    8.敲除ZNF649-AS1逆轉曲妥珠單抗的體內自噬作用
        基于我們的體外觀察,我們試圖通過在BALB/c裸鼠模型中建立異種移植來驗證我們的數據。通過從裸鼠身上剝離腫瘤,我們在治療20天后為不同組建立異種移植(圖8A)。在sh-ZNF649-AS1組中形成的腫瘤明顯小于sh-NC組(圖8B)。通過進行免疫組化(IHC)分析,我們發現由sh-ZNF649-AS1感染細胞形成的腫瘤與對照細胞形成的腫瘤相比,ATG5的表達水平降低(圖8C)。此外,在sh-ZNF649-AS1組的小鼠中觀察到低水平的LC3斑點(圖8D)和自噬體(圖8E)的形成。

    結論:
        我們發現ZNF649-AS1直接抑制ATG5的表達,從而抑制自噬,在乳腺癌抗曲妥珠單抗耐藥中起著關鍵作用。我們的研究結果為深入了解ncRNA調控的腫瘤治療效果提供了依據,并為開發更有效的策略來逆轉乳腺癌患者曲妥珠單抗耐藥性奠定了基礎。



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